قدم هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوق بها لقياس نشاط الفوشطات القلوية في ثقافة S.aureus biofilm. وسوف تساعدنا على فهم وظيفة ALP في تشكيل بيو فيلم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الإنتاجية العالية.
أنها حساسة جدا وسهلة لأداء. وإظهار الإجراء سيكون كيفن دانيكوفسكي، وهو طالب سابق من كلية هاربر. لإعداد TSB، إضافة هضم البنكرياس من الهاسين، هضم بابايك من وجبة فول الصويا، كلوريد الصوديوم، ديكستروز، والفوسفات ثنائيوتاسيوم في الماء المقطر.
تغطية القارورة مع رقائق الألومنيوم ووضعها في الأوتوكلاف لتعقيم قبل الاستخدام. لإعداد TSA، إضافة أجار إلى TSB ووضعها في الأوتوكلاف للتعقيم. ثم ندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، صب في طبق بيتري بنسبة 20 ملليلتر لكل طبق. لإعداد بيو فيلم ثقافة المتوسطة، إضافة الجلوكوز إلى TSB autoclaved لتحقيق تركيز 10 غراما للتر الواحد. باستخدام مجموعة الترشيح فراغ، الترشيح الحل مع 0.2 ميكرومتر المسام مرشح الحجم.
لتطعيم, استخدام حلقة تطعيم تعقيم لاختيار مستعمرة واحدة الفردية من اريوس Staph من طبق بيتري ووضعها في أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB. وضع أنبوب في الحاضنة لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. مع micropipette، رسم 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها ونقلها إلى أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB مع الجلوكوز لتخفيف نسبة 1:100 حجم.
دوامة بلطف لخلط لتركيز ثابت. استخدام micropipette لنقل 200 ميكرولترات من الثقافة المخففة في ما مجموعه 18 آبار من لوحة بئر واحدة 96. احتضان لوحة 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتشكيل بيو فيلم.
للحصول على أفضل تشكيل بيو فيلم من S.aureus، فمن الأفضل لاختيار شقة أو مستديرة أسفل 96 لوحة جيدا. بعد ذلك ، إمالة قليلا لوحة لdedeant ة من قبل الطموح من حافة كل بئر. غسل كل جيدا مع 1X PBS.
وضع لوحة في جهاز الطرد المركزي لتدور لمدة خمس دقائق في 8،000 الثورات في الدقيقة الواحدة وdesant من قبل الطموح. إضافة 75 ميكرولترات من الركيزة ALP المخزن تتكون من PNPP المتاحة تجاريا إلى كل بئر واستخدام جهاز توقيت لتسجيل كل نقطة زمنية في ثلاث ية. بعد كل وقت حضانة، إضافة 75 ميكرولترات من خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس إلى كل من الآبار الثلاثة لوقف رد الفعل.
جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 800 الثورات في الدقيقة. استخدام ماصة لنقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة 96 بئر جديدة لقياس القياسات الحرارية. استخدام قارئ لوحة 96 جيدا لقياس امتصاص كل بئر في 405 نانومتر.
استخدم آبار النقطة الزمنية التي تستغرق 30 دقيقة للتحكم في الضوضاء الخلفية. كرر التجربة بأكملها في ثلاث لوحات 96 جيدا. يطور هذا البروتوكول فحصًا سريعًا وموثوقًا لقياس نشاط ALP في S.aureus biofilm الذي لا يتطلب عزلًا للبروتين.
تظهر النتيجة التمثيلية لنشاط ALP اتجاهًا متزايدًا لمدة تصل إلى 75 دقيقة. بعد 75 دقيقة، لم يلاحظ أي زيادة في نشاط ALP. من المهم جداً إنشاء ثقافة بيو فيلم جيدة وقد يستغرق الأمر عددًا غير قليل من التجارب لإتقانها.
يمكنك تأكيد تشكيل بيو فيلم عن طريق إجراء فحص البنفسج الكريستال كما ذكرت سابقا من قبل لنا والآخرين أو يمكنك قبل علاج لوحة مع البلازما البشرية لتسهيل تشكيل بيو فيلم. بعد تطويره، يمكنك فحص مثبطات ALP المحتملة التي قد تتداخل تكوين بيو فيلم. وستوفر النتيجة معلومات مهمة نحو إدارة الأفلام البيولوجية في المجال الطبي.
خمسة صوديوم هيدروكسيد الصوديوم الضرس قد تكون خطرة في حالة الاتصال. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل معها.
