从脐带血源性多能干细胞中提取三维皮肤有机细胞

脐带血单核细胞（CBMC）已成为再生医学的潜在细胞来源，因为人类白细胞抗原类型对细胞库系统至关重要。CBMC诱导的多能干细胞，或CMBC-iPSC，可以分化成角蛋白细胞和成纤维细胞。为了产生3D皮肤器官，我们使用皮肤学研究。

首先在37摄氏度和10%的二氧化碳下将CBMC-iPSC培养到镀维特龙素涂层的100毫升板上。当细胞达到80%的汇合时，用PBS洗涤培养物，每盘一毫升一毫升EDTA，在37摄氏度和5%的二氧化碳下治疗两分钟。当细胞分离后，停止每板三毫升E8介质的反应，通过离心收集细胞。

将颗粒重新悬浮在五毫升E8介质中进行计数，将一次-10至六分之六的细胞转移到15毫升锥形管中进行离心。用2.5毫升的胚胎体形成介质重新悬浮转移的细胞，辅以10微摩尔罗相关激酶，或 ROCK抑制剂。使用移液器将 125 微升的细胞液滴转移到未涂覆的培养板盖上。

放置所有液滴后，将盘子翻过来，让液滴在37摄氏度和5%的二氧化碳下从盖子上悬挂24小时。第二天，用新鲜的E8介质清洗盖子，将胚胎体溶液转移到50毫升锥形管中。允许胚胎体在室温下沉淀一分钟，然后吸上一清液，用新鲜E8培养的胚胎体在37摄氏度的90毫米培养皿中重新悬浮，直到其分化。

对于CBMC-iPSC角蛋白分化，用新鲜的E8培养基取代胚胎体培养物的E8培养基，辅以每毫升骨质原蛋白4的一毫微克，在37摄氏度和5%的二氧化碳下24小时孵育。第二天，将胚胎身体收获成50毫升的圆锥管，让胚胎在室温下沉淀一分钟。接下来，用六毫升角蛋白细胞分化介质 1 或 KDM1 替换上一代，辅以 10 微摩尔 ROCK 抑制剂，将胚胎体转移到四型胶原蛋白涂层的 100 毫米培养皿中。

在培养的天零到八天，每隔一天用新鲜的KDM1代替介质，辅以三微摩尔视网膜酸和每毫升25毫微克，每毫升骨形态遗传蛋白4和表皮生长因子。第9天至12天，每隔一天用KDM2代替介质，辅以三微摩尔视网膜酸，每毫升骨形态遗传蛋白25毫微克4，每毫升表皮生长因子20毫微克。第13天至30天，每隔一天将介质更改为KDM3，每毫升骨形态遗传蛋白4，每毫升20毫微克，每毫升表皮生长因子20毫微克。

对于CBMC-iPSC成纤维细胞分化，在6毫升成纤维细胞分化介质1中重新悬浮胚胎体培养，辅以10微摩尔 ROCK抑制剂，将胚胎体悬浮转移到地下室膜基质涂层的100毫米培养皿中。经过三天的孵育，用0.5纳米摩尔骨形态遗传蛋白4治疗培养物4天，然后将培养基改变为成纤维细胞分化介质2。在文化的第七天，每隔一天将介质更改为 FDM2 一周。

在培养的第14天，分离细胞与一毫摩尔EDTA如证明，并收集细胞在三毫升的成纤维细胞分化介质2离心。将细胞重新悬浮在五毫升成纤维细胞分化介质1中进行计数，并转移两次至十至六分之六的细胞至非涂层培养皿。在培养的第21天，将培养的两次-10至6-6细胞转移到新鲜成纤维细胞分化介质1的一型胶原蛋白涂层100毫米培养皿。

在培养的第28天，将两次-10至6个 iPSC 衍生的成纤维细胞转移到一个新的非涂层菜。对于三维皮肤器官生成，从培养中收获 iPSC 衍生的成纤维细胞，将两次-10 到 50 细胞转移到 15 毫升锥形管中进行离心。将成纤维细胞颗粒重新悬浮在1.5毫升的成纤维细胞分化介质1和1.5毫升的中和 I 型胶原蛋白溶液中。

在室温下，在六孔微孔板中孵育刀片上的细胞30分钟。当溶液凝固后，在刀片顶部加入两毫升介质，在井底加入三毫升。然后将成纤维细胞基质放入培养箱中五到七天，直到凝胶完成，基质不再收缩。

在孵育结束时，收获 iPSC 衍生的角蛋白细胞，将一次-10 至 6 次细胞转移到 15 毫升锥形管中进行离心。将颗粒重新悬浮在50至100微升的低钙上皮介质1中，用角蛋白细胞溶液取代成纤维细胞基质的介质。在37摄氏度下15分钟后，用两毫升的上皮介质1替换刀片顶部的介质，用三毫升的上皮介质将刀片的介质更换，并将板返回孵化器。

两天后，用正常的钙上皮介质2替换插入物中的培养，再进行两天的培养。在培养的第四天，去除所有的培养，并添加三毫升的玉米化介质到底部井只，以产生一个空气-液体接口。然后将板返回孵化器长达 14 天，然后收获 3D 皮肤器官进行下游分析。

CBMC-iPSC衍生的角蛋白细胞具有类似于原发性角蛋白细胞的形态，在这些细胞中增加了角蛋白细胞标记的表达。CBMC-iPSC衍生的成纤维细胞具有类似于原发性成纤维细胞的形态，多能干细胞标记10月4日的表现受到低调节，而成纤维细胞标记则向上调节。3D皮肤器官的厚度在3D培养过程中增加，确认3D皮肤器官是由 iPSC 衍生的角蛋白细胞和成纤维细胞产生的。

两周后，移植的3D皮肤器官移植有效整合到受体小鼠皮肤，HNE分析证实。此外，角蛋白细胞成熟和表皮分化标记在CBMC-iPSC衍生的3D皮肤器官中表达，表现出功能分化，有效的移植，并有效愈合小鼠皮肤缺陷。我们过去使用高钙介质，诱导分层的3D皮肤器官层模仿皮肤附近。

分析表明皮肤是分层的。CBMC-iPSC 是皮肤移植的潜在细胞来源，CBMC-iPSC 衍生的 3D 皮肤器官可用于与皮肤科、美容筛查和再生医学相关的研究。