本协议提供的细节涉及人类皮肤等价的一代，这在技术上往往具有挑战性。包括新型人类皮肤等效协议元素，如血管和体积成像。该技术使皮肤模型能够直接构建，使活体组织更紧密地匹配，用于疾病、衰老和个性化医学的研究。
该协议最具挑战性的部分是潜水和空气液体接口之间的过渡。可能需要一些试验来优化时间和媒体水平，以获得一致的结果。首先，在冷盖管中加入 516 微升介质，并立即使用 1000 微升正位移移液器添加 375 微升冷胶原蛋白。
取出空移液器尖端，切换到准备好的 250 微升正位移移器混合。快速混合，但轻轻防止过多的气泡形成。将尖端保持在溶液中，从管的不同位置均匀混合，直到溶液具有均匀的颜色，通常需要大约 5 个移液器周期或 10 秒。
立即将125微升的细胞胶原蛋白分散到12井文化插入物的膜上。为了确保均匀覆盖，倾斜板和使用移液器尖通过轻轻地传播胶原蛋白来涂漆膜。立即将12井板移到37摄氏度的细胞培养孵化器，使其凝胶至少20分钟。
凝胶期后，将12井的细胞胶原蛋白从孵化器中取出。从湿冰中取出1.7毫升盖管，然后从制冷中取出库存胶原蛋白，并将其盖上盖子放在湿冰上。在冷盖管中加入 516 微升冷却细胞悬架。
使用 1000 微升移液器立即将 375 微升冷胶原蛋白溶液直接放入封顶管内的溶液中。将所有胶原蛋白从移液器中排出到管中，并丢弃正位移移器尖端。立即切换到 250 微升移液器，混合胶原蛋白溶液混合后，将 250 微升的细胞胶原蛋白溶液转移到 12 井培养插入的细胞胶原蛋白支架上，然后将 12 井板移动到 37 摄氏度的细胞培养孵化器。
30分钟凝胶时间后，轻轻倾斜板，以评估凝胶，并确保胶原蛋白凝固。在插入的上腔和下腔分别添加 500 微升和 1000 微升混合介质。确保胶原蛋白凝胶被淹没，如有必要，添加更多介质。
将井板放在细胞培养孵化器中，进行夜间孵化。在潜水第七天，使用手动移液器收集和丢弃每个构造井的底部和顶部腔室的介质。要收集直接卡在透水膜下的介质，请将移液器尖端放在膜下，暂时将插入物敲出位置。
在每口井的下腔加入一毫升的人体皮肤等价物或HSE介质，在每口井的下腔加5%FPS，在每口井的顶室加入200微升细胞悬浮剂。将角蛋白细胞直接播种到皮肤构造表面，使其在孵化器中沉淀两小时。播种角蛋白细胞两小时后，小心地加入 300 微升 HSE 介质，在每口构造井的顶室中补充 5% FPS。
加载介质后，将构造放回孵化器。使用手动移液器，仅从上腔中去除介质废物，将每个构造提升到其空气液体接口（ALI）。尽量靠近表皮层，不要接触或损坏表皮层。
将板稍微倾斜不同角度以收集介质，然后向板内周围的井中加入大约两毫升无菌水，以保持一致的湿度。几个小时后检查盘子，以确保角蛋白细胞仍然在ALI。移除上腔的任何介质，跟踪从每口井中移出的介质量。
表皮层应看起来水合，而不是干燥，但不应在构造顶部集中介质。要准备免疫荧光染色结构，请倒置插入物，将其放在井板上的井上。用一只手稳定插入，同时使用细尖钳或精密刀切开膜约一半的周长。
尽可能靠近塑料外壳。使用细尖钳，抓住切膜皮瓣的边缘，轻轻剥去插入物和 VHSE 构造上的多孔膜。如果构造卡在房间的一侧，使用细尖钳或小铲将其移到井中。
一旦 VHSE 进入井中，丢弃插入膜的任何剩余部分，并将培养物插入每个井中，以便在染色过程中将 VHSE 置于水下位置。成像前两天，准备聚二甲基硅氧烷或PDMS。将任何干净的混合容器放在称重平衡上，并擦干秤。
添加基座，然后添加交联器。大力搅拌溶液至少四分钟，产生小气泡。充分混合后，将 PDMS 倒入 90 或 100 毫米的培养皿中。
将 PDMS 在真空室中除以，直到所有气泡消失且 PDMS 清晰。缓慢释放真空并去除 PDMS。将菜放入烤箱中，在 50 至 60 摄氏度下过夜治疗，确保菜平坐，让 PDMS 均匀地治愈。
成像前一天，使用钢冲床或手持式精密刀从 PDMS 板上打孔或切出圆形井，其大小与 VHSE 结构大致相同。在圆形油井周围切一个方形补丁，以创建一个单个 PDMS 井。使用与 PDMS 大小相近的玻璃盖滑，将氰丙烯酸酯胶水添加到 PDMS 的底部表面，并用一次性移液器尖端均匀涂抹。
将玻璃放在中心，并将其压在 PDMS 上，同时在打孔的圆圈内留下一个透明的玻璃窗。使用前让胶水干燥过夜。表皮和真皮的特征在 VHSE 结构中显示人类皮肤的适当免疫荧光标记。
细胞克制素10是一种早期分化角质细胞标记物，通常标记皮肤等价物中的所有超巴塞层。非自愿和丝虫是角蛋白细胞中后期分化标记，并标记皮肤等价物中上部最超巴塞层。清除 VHSE 允许在一个设置中进行直接成像，并消除了将构造重新定向以分别映像真皮和表皮的需要。
体积图像使生成 3D 渲染成为绘制每个构造中血管图的可能。图像堆栈已加载到计算软件中，并使用自定义算法进行 3D 渲染和量化。骨架化确定了每个胶原蛋白IV标记容器的确定中心，并使用由此产生的数据来计算容器直径和血管分数。
按照这个程序，可以执行特征分析、扫描电子显微镜、脂质轮廓等方法，以了解血管学如何特别影响表皮成熟和稳定性。此协议支持血管化皮肤模型中的组织相关和细胞类型特定研究。它特别适合研究老化和个性化的医学。
