Моноядерные клетки пуповинной крови, или CBMC, стали потенциальным источником клеток для регенеративной медицины, потому что типирование антигена лейкоцитов человека имеет важное значение для клеточной банковской системы. КБМК-индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, или CMBC-iPSCs, могут быть дифференцированы в кератиноциты и фибробласты. Для создания органоидов 3D кожи мы используем дерматологические исследования.
Начните с культивирования CBMC-iPSC на пробиркецин покрытием 100-миллилитровые пластины при 37 градусов по Цельсию и 10%углекислого газа. Когда клетки достигли 80%-ного слияния, мыть культуры с PBS, и лечить их с одним миллилитром одного миллимолярной ЭДТА на тарелку в течение двух минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с тремя миллилитров E8 среды на тарелку, и собирать клетки центрифугации.
Повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров E8 среды для подсчета, и передачи один раз-10-к-шестой клетки в 15-миллилитровой конической трубки для центрифугации. Повторно приостанавливать переданные клетки с 2,5-миллилитров эмбриональной среды формирования тела, дополняется 10-микромолярной родо-ассоциированной киназы, или ингибитором ROCK. Используйте пипетку для переноса 125-микролитровых капель клеток на крышку пластины с неокрашенной культурой.
Когда все капли были помещены, перевернуть блюдо, чтобы капли висеть с крышки в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующий день промойте крышку свежей средой E8 и перенесите раствор эмбрионального тела в 50-миллилитровую коническую трубку. Позвольте эмбриональным телам поселиться в течение одной минуты при комнатной температуре, прежде чем аспирировать супернатант и вновь приостановить эмбриональные тела со свежей средой E8 для их культуры в 90-миллиметровой чашке Петри при температуре 37 градусов по Цельсию и 5%углекислом газе до их дифференциации.
Для дифференциации кератиноцитов CBMC-iPSC замените среду E8 из эмбриональной культуры тела свежей средой E8, дополненной одним нанограммом на миллилитр костного морфогенетического белка 4 для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. На следующий день, урожай эмбриональных тел в 50-миллилитровую коническую трубку, как попродемонстрировано, и позволить телам поселиться в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем замените супернатант шестью миллилитров кератиноцитов дифференциации среднего 1, или KDM1, дополненный 10 микромолейным ингибитором ROCK, и перенесите эмбриональные тела в 100-миллиметровую тарелку с коллагеновым покрытием IV типа.
В дни от нуля до восьми культуры, заменить средний через день со свежим KDM1, дополненный трехмимоларной ретинойной кислоты и 25 нанограмм на миллилитр каждого из костного морфогенетического белка 4 и эпидермального фактора роста. Между днями 9 до 12, заменить средний через день с KDM2, дополненный тремя микромолярной ретинойной кислотой, 25 нанограмм на миллилитр костного морфогенетического белка 4, и 20 нанограмм на миллилитр эпидермального фактора роста. Между днями с 13 по 30, изменить среду через день на KDM3, дополненный 10 нанограммов на миллилитр костного морфогенетического белка 4, и 20 нанограмм на миллилитр эпидермального фактора роста.
Для дифференциации фибробластов CBMC-iPSC повторно приостанавливать эмбриональную культуру тела в шести миллилитров фибробластовой дифференциации среднего 1, дополненного 10-микромолярной ингибитором ROCK, и перенести эмбриональную подвеску тела в подвальные мембранные матрицы с покрытием 100-миллиметровой тарелки. После трех дней инкубации, лечить культуру с 0,5-наномолярной кости морфогенетического белка 4 в течение четырех дней, прежде чем изменить средний на фибробластов дифференциации среды 2. На седьмой день культуры, изменить средний FDM2 через день в течение одной недели.
На 14-й день культуры отсоедините клетки с одномимолярной ЭДТА, как было продемонстрировано, и соберите клетки в три миллилитра фибробластовой дифференциации среды 2 для центрифугации. Повторно приостанавливать клетки в пяти миллилитров фибробластовой дифференциации среды 1 для подсчета, и передать два раза-10-к-шестой клетки, не покрытием блюдо. На 21-й день культуры, передача два раза-10-к-шестой клетки из культуры в тип I коллагена покрытием 100-миллиметровое блюдо в свежем фибробласта дифференциации среды 1.
На 28-й день культуры перенесите два раза-10-к-шести из iPSC-производных фибробластов в новое блюдо без покрытия. Для трехмерного генерации органоидов кожи, урожай iPSC полученных фибробластов из культуры, и передать два раза-10-к-пятой клетки 15-миллилитровой конической трубки для центрифугации. Повторно приостанавливайте фибробласты гранулы в 1,5 миллилитров фибробластовой дифференциации среднего 1 и 1,5 миллилитров нейтрализованного раствора коллагена типа I.
Инкубировать клетки на вставку в шесть хорошо микроплюрат в течение 30 минут при комнатной температуре. Когда раствор затвердеют, добавьте два миллилитров среднего к верхней части вставки, и три миллилитров в нижней части хорошо. Затем поместите фибробластовую матрицу в инкубатор на пять-семь дней, пока гелеобразование не завершится, и матрица больше не будет работать.
В конце инкубации, урожай iPSC полученных кератиноцитов, и передачи один раз-10-к-шестой клетки 15-миллилитровой конической трубки для центрифугации. Повторно приостанавливайте гранулы в 50-100 микролитров эпителиальной среды с низким содержанием кальция 1 и заменяйте среду на фибробластовую матрицу раствором клеток кератиноцита. Через 15 минут при 37 градусах цельсия замените среду в верхней части вставки двумя миллилитров эпителиальной среды 1, а среду в нижней хорошо с тремя миллилитров же, и вернуть пластину в инкубатор.
Через два дня замените среду в вставке и колодец нормальной эпителиальной средой кальция 2 в течение двух дополнительных дней культуры. На четвертый день культуры, удалить все среды, и добавить три миллилитров роговицы среды на дно только, для создания воздухо-жидкого интерфейса. Затем верните пластину в инкубатор на срок до 14 дней до сбора органоида 3D кожи для анализа ниже по течению.
Кератиноциты, полученные CBMC-iPSC, имеют морфологию, похожую на первичные кератиноциты, и экспрессия маркеров кератиноцитов увеличивается в этих клетках. CBMC-iPSC полученных фибробластов имеют морфологию похож на первичные фибробласты, и выражение плюрипотентных маркеров стволовых клеток октября-4 является вниз регулируется, в то время как фибробласты маркеры до регулируется. Толщина органоида 3D кожи увеличивается во время 3D-культуры, подтверждая, что органоид 3D кожи генерируется из кератиноцитов и фибробластов, полученных iPSC.
Через две недели пересаженый 3D органоидный трансплантат кожи эффективно включается в кожу мыши-реципиента, что подтверждается анализом HNE. Кроме того, кератиноцит созревания и эпидермальной дифференциации маркеры выражаются в CBMC-iPSC полученных 3D органоидов кожи, демонстрируя функциональную дифференциацию, эффективное прививки, и эффективное заживление дефектов кожи мыши. Мы используем в прошлом с высоким содержанием кальция среды, которая вызывает стратифицированных слоев органоида 3D кожи, чтобы имитировать вблизи кожи.
анализ показывает, что кожа стратифицирована. CBMC-iPSCs являются потенциальным источником клеток для пересадки кожи, и CBMC-iPSC полученных 3D органоидов кожи могут быть использованы в исследованиях, связанных с дерматологией, косметический скрининг, и регенеративной медицины.
