Le cellule mononucleari del sangue del cordone ombelicale, o CBMC, sono emerse come una potenziale fonte cellulare per la medicina rigenerativa, perché la tipizzazione dell'antigene leucocitare umano è essenziale per il sistema bancario cellulare. Le cellule staminali pluripotenti indotte dal CBMC, o CMBC-iPSC, possono essere differenziate in cheratinociti e fibroblasti. Per generare organoide cutaneo 3D, stiamo usando la ricerca dermatologica.
Inizia coltivando CBMC-iPSC su piastre da 100 millilitri rivestite di vitronectina a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica. Quando le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le colture con PBS e trattarle con un millilitro di EDTA millimolare per piastra per due minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con tre millilitri di mezzo E8 per piastra e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Sospendere di nuovo i pellet in cinque millilitri di mezzo E8 per il conteggio e trasferire una per 10-10-sesta celle in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere nuovamente le cellule trasferite con 2,5 millilitri di mezzo di formazione del corpo embrionale, integrato con 10-micromolare rho-associated chinasi, o inibitore ROCK. Utilizzare una pipetta per trasferire goccioline di celle da 125 microliter su un coperchio di piastra di coltura non rivestito.
Quando tutte le goccioline sono state posizionate, girare il piatto per consentire alle goccioline di appendere dal coperchio per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, lavare il coperchio con un mezzo E8 fresco e trasferire la soluzione del corpo embrionale in un tubo conico da 50 millilitri. Lasciare che i corpi embrionali si sistemino per un minuto a temperatura ambiente, prima di aspirare il supernatante e sospendere di nuovo i corpi embrionali con mezzo E8 fresco per la loro coltura in una piastra di Petri di 90 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino alla loro differenziazione.
Per la differenziazione dei cheratinociti CBMC-iPSC, sostituire il mezzo E8 dalla coltura del corpo embrionale con un mezzo E8 fresco, integrato con un nanogrammo per millilitro di proteina morfogenetica ossea 4 per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, raccogliere i corpi embrionali in un tubo conico da 50 millilitri come dimostrato e consentire ai corpi di stabilirsi per un minuto a temperatura ambiente. Successivamente, sostituire il supernatante con sei millilitri di mezzo di differenziazione dei cheratinociti 1, o KDM1, integrato con 10 inibitori ROCK micromolari, e trasferire i corpi embrionali in un piatto da 100 millimetri rivestito di collagene di tipo IV.
Nei giorni da zero a otto di coltura, sostituire il mezzo a giorni nostri con KDM1 fresco, integrato con acido retinoico trimolare e 25 nanogrammi per millilitro ciascuno della proteina morfogenetica ossea 4 e fattore di crescita epidermico. Tra i nove e i 12 giorni, sostituire il mezzo a giorni nostri con KDM2, integrato con acido retinoico trimolare, 25 nanogrammi per millilitro della proteina morfogenetica ossea 4 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico. Tra i giorni 13 e 30, cambiare il mezzo a giorni diversi in KDM3, integrato con 10 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea 4 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico.
Per la differenziazione dei fibroblasti CBMC-iPSC, sospendere nuovamente la coltura embrionale del corpo in sei millilitri di differenziazione dei fibroblasti medium 1, integrati con inibitore ROCK 10 micromolare, e trasferire la sospensione del corpo embrionale in un piatto da 100 millimetri rivestito con matrice di membrana basale. Dopo tre giorni di incubazione, trattare la coltura con proteina morfogenetica ossea 0,5 nanomolare 4 per quattro giorni, prima di cambiare il mezzo di differenziazione medio-fibroblasto 2. Il settimo giorno di cultura, cambia il mezzo in FDM2 a giorni diversi per una settimana.
Il giorno 14 di coltura, staccare le cellule con EDTA millimolare come dimostrato e raccogliere le cellule in tre millilitri di differenziazione dei fibroblasti mezzo 2 per la centrifugazione. Sospendere di nuovo le cellule in cinque millilitri di mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1 per il conteggio e trasferire due volte 10-al-sesto cellule in un piatto non rivestito. Il giorno 21 di coltura, trasferire due volte 10-al-sesto cellule dalla coltura a un piatto di 100 millimetri rivestito di collagene di tipo I in mezzo di differenziazione dei fibroblasti freschi 1.
Il giorno 28 di coltura, trasferire due volte-10-al-sei dei fibroblasti derivati da iPSC in un nuovo piatto non rivestito. Per la generazione tridimensionale di organoidi della pelle, raccogliere i fibroblasti derivati dall'iPSC dalla coltura e trasferire due volte 10-al-quinto cellule in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet di fibroblasti in 1,5 millilitri di mezzo di differenziazione dei fibroblasti 1 e 1,5 millilitri di soluzione di collagene di tipo I neutralizzata.
Incubare le cellule su un inserto in una micropiatta a sei porri per 30 minuti a temperatura ambiente. Quando la soluzione si è solidificata, aggiungere due millilitri di mezzo alla parte superiore dell'inserto e tre millilitri sul fondo del pozzo. Quindi posizionare la matrice di fibroblasti nell'incubatrice per cinque o sette giorni, fino al completamento della gelazione, e la matrice non si contrae più.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere i cheratinociti derivati dall'iPSC e trasferire cellule uno-per-10-al-sesto in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet in 50-100 microlitri di mezzo epiteliale a basso calcio 1 e sostituire il mezzo sulla matrice dei fibroblasti con la soluzione cellulare cheratinocita. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, sostituire il mezzo nella parte superiore dell'inserto con due millilitri di mezzo epiteliale 1 e il mezzo nella parte inferiore bene con tre millilitri dello stesso e restituire la piastra all'incubatore.
Dopo due giorni, sostituire il mezzo nell'inserto e il pozzo con il normale mezzo epiteliale di calcio 2 per altri due giorni di coltura. Il quarto giorno di coltura, rimuovere tutto il mezzo e aggiungere tre millilitri di mezzo di cornificazione solo sul fondo bene, per generare un'interfaccia aria-liquido. Quindi restituire la piastra all'incubatore per un massimo di 14 giorni prima di raccogliere l'organoide della pelle 3D per l'analisi a valle.
I cheratinociti derivati da CBMC-iPSC hanno morfologie simili ai cheratinociti primari, e l'espressione dei marcatori cheratinociti è aumentata in queste cellule. I fibroblasti derivati da CBMC-iPSC hanno una morfologia simile ai fibroblasti primari, e l'espressione del marcatore di cellule staminali pluripotenti Oct-4 è regolata verso il basso, mentre i marcatori di fibroblasti sono regolati verso l'alto. Lo spessore dell'organoide della pelle 3D aumenta durante la coltura 3D, confermando che l'organoide della pelle 3D è generato da cheratinociti e fibroblasti derivati da iPSC.
Dopo due settimane, un innesto organoide della pelle 3D trapiantato si incorpora in modo efficiente in una pelle di topo ricevente, come confermato dall'analisi HNE. Inoltre, i marcatori di maturazione dei cheratinociti e differenziazione epidermica sono espressi negli organoidi della pelle 3D derivati da CBMC-iPSC, dimostrando una differenziazione funzionale, un innesto efficiente e una guarigione efficace dei difetti della pelle del topo. Usiamo in passato con l'alto mezzo calcio che induce strati stratificati di organoide della pelle 3D a imitare vicino alla pelle.
l'analisi mostra che la pelle è stratificata. I CBMC-iPSC sono una potenziale fonte cellulare per gli innesti cutanei e gli organoidi della pelle 3D derivati da CBMC-iPSC possono essere utilizzati in studi relativi alla dermatologia, allo screening cosmetico e alla medicina rigenerativa.
