وقد برزت خلايا أحادية النوى في دم الحبل السري، أو CBMC، كمصدر محتمل للخلايا للطب التجديدي، لأن كتابة مستضد الكريات البيض البشرية أمر ضروري للنظام المصرفي للخلايا. يمكن تمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يستحثها CBMC ، أو CMBC-iPSCs ، إلى خلايا الكيراتينوس والالخلايا الليفية. لتوليد 3D الجلد organoid، ونحن نستخدم البحوث الجلدية.
تبدأ من خلال زراعة CBMC-iPSC على الصفائح المغلفة فيلتر 100 ملليلتر في 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما وصلت الخلايا إلى 80٪ التقاء، وغسل الثقافات مع برنامج تلفزيوني، وعلاجها مع ملليلتر واحد من EDTA ملليمتر واحد لكل صفيحة لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تكون الخلايا منفصلة، ووقف رد فعل مع ثلاثة ملليلتر من E8 المتوسطة لكل لوحة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من E8 المتوسطة للعد، ونقل مرة واحدة-10-إلى-الخلايا السادسة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا المنقولة مع 2.5 ملليلتر من تكوين الجسم الجنينية المتوسطة, تستكمل مع 10 ميكرومولار rho المرتبطة كيناز, أو مثبط روك. استخدم ماصة لنقل قطرات من الخلايا سعة 125 ميكرولتر إلى غطاء لوحة ثقافة غير مصقول.
عندما تم وضع جميع القطرات، قم بتسليم الطبق للسماح للصقطرات بالشنق من الغطاء لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، اغسل الغطاء بوسيلة E8 جديدة، ونقل محلول الجسم الجنيني إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. السماح للأجسام الجنينية لتسوية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، قبل التعرق وإعادة تعليق الهيئات الجنينية مع E8 المتوسطة الطازجة لثقافتها في طبق بيتري 90 ملليمتر في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تمايزها.
لتمايز الكيراتينوتيات CBMC-iPSC، استبدل وسيط E8 من ثقافة الجسم الجنينية بوسيطة E8 جديدة، مكمّلة بمليمتر نانوغرام واحد لكل ملليلتر من البروتين الموروجينيك العظمي 4 لاحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، حصاد الهيئات الجنينية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر كما هو موضح ، والسماح للأجسام لتسوية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استبدل الماظر بست ملليلترات من تمايز الكيراتينوسيت المتوسط 1، أو KDM1، المكملة بمثبط 10 ميكرومولار روك، ونقل الأجسام الجنينية إلى طبق من النوع IV الكولاجين المغلفة 100 ملليمتر.
في الأيام صفر من خلال ثمانية من الثقافة، واستبدال المتوسطة كل يومين مع KDM1 الطازجة، وتستكمل مع حمض الريتينويك ثلاثة ميكرومولار و 25 نانوغرام لكل ملليلتر كل من البروتين مورمورفينتيك العظام 4 وعامل نمو البشرة. بين الأيام التسعة إلى الثانية عشرة، استبدل الوسط كل يوم بـ KDM2، المكمل بحمض الشبكية ثلاثية الميكروفوالار، و25 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين المورفوجينيك العظمي 4، و20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نمو البشرة. بين أيام 13 إلى 30، تغيير المتوسطة كل يومين إلى KDM3، تستكمل مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورمورفينتيك العظام 4، و 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نمو البشرة.
لCBMC-iPSC التمايز في الخلايا الليفية، وإعادة تعليق ثقافة الجسم الجنينية في ستة ملليلتر من التمايز الليفي المتوسطة 1، تستكمل مع مثبط الصخور 10 ميكرومولار، ونقل تعليق الجسم الجنينية إلى غشاء الطابق السفلي المغلفة مصفوفة 100 ملليمتر الطبق. بعد ثلاثة أيام من الحضانة، علاج الثقافة مع 0.5 نانومولار بروتين مورفوجينيك العظام 4 لمدة أربعة أيام، قبل تغيير المتوسطة إلى التمايز الليفي المتوسطة 2. في اليوم السابع من الثقافة، قم بتغيير الوسط إلى FDM2 كل يومين لمدة أسبوع واحد.
في اليوم 14 من الثقافة، وفصل الخلايا مع EDTA واحد ملليمولار كما هو موضح، وجمع الخلايا في ثلاثة ملليلتر من التمايز الليفي المتوسط 2 للطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من التمايز الليفي المتوسط 1 للعد، ونقل مرتين-10-إلى-الخلايا السادسة إلى طبق غير المغلفة. في اليوم 21 من الثقافة، نقل مرتين-10-إلى-السادس الخلايا من الثقافة إلى طبق الكولاجين من النوع الأول المغلفة 100 ملليمتر في التمايز الليفي الطازج متوسط 1.
في اليوم 28 من الثقافة، نقل مرتين من 10 إلى 6 من الخلايا الليفية المشتقة من iPSC إلى طبق جديد غير مغلف. لتوليد الجلد العضوي ثلاثي الأبعاد، حصاد الخلايا الليفية المشتقة من iPSC من الثقافة، ونقل مرتين-10-إلى-الخامس الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في الخلايا الليفية في 1.5 ملليلتر من التمايز الليفي المتوسطة 1، و 1.5 ملليلتر من حل الكولاجين النوع الأول تحييد.
احتضان الخلايا على إدراج في لوحة صغيرة من ستة بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما يكون الحل قد توطدت، إضافة ملليلترين من المتوسطة إلى أعلى إدراج، وثلاثة ملليلترات إلى أسفل البئر. ثم ضع المصفوفة الليفية في الحاضنة لمدة خمسة إلى سبعة أيام ، حتى يكتمل الجلاة ، ولم تعد المصفوفة تتقلص.
في نهاية الحضانة، حصاد الخلايا الكيراتينوسية المشتقة من iPSC، ونقل مرة واحدة-10-إلى-السادسة الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في 50 إلى 100 ميكرولترات من متوسطة ظهارية منخفضة الكالسيوم 1، واستبدال المتوسطة على مصفوفة الخلايا الليفية مع محلول خلية keratinocyte. بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، واستبدال المتوسطة في الجزء العلوي من إدراج مع مليلتر اثنين من المتوسطة الظهارية 1، والمتوسطة في أسفل جيدا مع ثلاثة ملليلتر من نفسه، والعودة لوحة إلى الحاضنة.
بعد يومين، استبدال المتوسطة في إدراج وبيع من خلال متوسط ظهاري الكالسيوم العادي 2 لمدة يومين إضافيين من الثقافة. في اليوم الرابع من الثقافة، وإزالة كل من المتوسطة، وإضافة ثلاثة ملليلتر من متوسطة التحنين إلى أسفل جيدا فقط، لتوليد واجهة الهواء السائل. ثم ارجع إلى الحاضنة لمدة تصل إلى 14 يومًا قبل حصاد الجهاز العضوي ثلاثي الأبعاد للجلد لتحليل المصب.
تحتوي خلايا الكيراتينوسيات المشتقة من CBMC-iPSC على مورفولوجيا مشابهة لـ keratinocytes الابتدائية، ويتم زيادة تعبير علامات الكيراتينوسيت في هذه الخلايا. تحتوي الخلايا الليفية المشتقة من CBMC-iPSC على مورفولوجيا مماثلة للخلايا الليفية الأولية ، والتعبير عن علامة الخلايا الجذعية متعددة القدرات Oct-4 منظمة لأسفل ، في حين أن علامات الخلايا الليفية هي منظمة. يزيد سمك الجهاز الجلد 3D خلال الثقافة 3D، مما يؤكد أن يتم إنشاء الجهازية الجلد 3D من keratinocytes المشتقة من iPSC والألواء الليفية.
بعد أسبوعين، يتم دمج الكسب غير المشروع العضوي الجلدي ثلاثي الأبعاد المزروع بكفاءة في جلد فأرة المتلقي، كما أكد تحليل HNE. وعلاوة على ذلك، يتم التعبير عن نضوج الكيراتينوتيت وعلامات التمايز البشرة في تشوهات الجلد ثلاثية الأبعاد المشتقة من CBMC-iPSC، مما يدل على تمايز وظيفي، تطعيم فعال، وشفاء فعال لعيوب جلد الماوس. نستخدمها في الماضي مع متوسطة الكالسيوم العالية التي تحفز طبقات طبقية من الأعضاء الجلد 3D لتقليد بالقرب من الجلد.
تحليل يبين أن الجلد هو طبقات. CBMC-iPSCs هي مصدر محتمل للخلايا لطعوم الجلد، ويمكن استخدام العضوية الجلدية ثلاثية الأبعاد المستمدة من CBMC-iPSC في الدراسات المتعلقة بالأمراض الجلدية والفحص التجميلي والطب التجديدي.
