新的显微镜技术需要开发足够的工具，以便正确理解所研究的生物过程。该协议描述了单分子跟踪所需的图像处理步骤，包括横向扩散参数的估计和细胞膜上整个轨迹的点大小的量化。该协议结合了使用多个软件片段，包括 ImageJ、MATLAB 和 uTrack，以及一些专为该协议开发的蛋白质。
这种方法在光显微镜下跟踪膜受体，但可以应用于任何粒子状结构，其轨迹可以在视频序列中随着时间的推移进行跟踪。该技术与基础研究有关，在临床环境中没有直接应用。然而，它可以用来帮助描述不同疾病的生物事件，从而确定新的治疗目标。
如本视频所示，此协议与细胞膜中的颗粒跟踪相关，但它也可用于跟踪流体中的全细胞、细菌、纳米粒子，或能够很好地确定中心的其他物体。该协议是用户友好的，只需要细胞培养和显微镜技术的知识。本协议中采用的不同技术和信息工具可能会恐吓新用户。
视觉演示有助于人们自信地使用这种技术。首先，生长Jurkat细胞，用单体GP标记的化疗受体载体进行转染，并选择标记载体表达水平较低的细胞，如随附的文本协议所述。将包含 CXCL12 配体或控制介质的介质添加到每个涂有纤维素涂层的 35 毫米玻璃底微井盘上，这些盘面都涂有纤维素，并在 37 摄氏度下孵育一小时。
接下来，将排序的细胞添加到每个培养皿中，并在对细胞进行成像前孵育20分钟。孵育后，将第一盘细胞转移到TIRF显微镜阶段，并转向100倍油浸没目标。使用亮场定位并聚焦在细胞上，以尽量减少光漂白效果。
然后切换到 TIRF 模式，并使用低激光强度执行精细对焦调整。获取大约 50 秒长度的影片，最大限度地减少帧之间的时间间隔。对于每个实验条件视频文件，按照此视频的文本协议中描述的文件结构方向创建一个新文件夹。
通过拖放斐济菜单栏上的文件，打开与斐济或 ImageJ 的视频，然后单击"确定"以使用生物格式导入 LIF 文件。为了设计蒙版，还要导入相应的多通道图像。接下来，首先使用对蒙版设计有用的通道创建单个图像，从而创建蒙版。
在栏菜单中选择"图像"，然后单击"颜色"后跟"拆分通道"，将不同的通道作为单独的图像显示。通过在栏菜单中选择"图像"、选择"颜色"和"合并通道"，再次合并单个图像中的三个通道。请确保选择适当的通道，然后按"确定"生成新的非堆叠图像。
通过进入栏菜单、选择"分析"，然后选择"工具"和"同步窗口"来同步两个窗口。将显示一个具有同步图像可能性的新窗口。现在，同步两个窗口后，可以裁剪两个窗口中的相同区域。
转到栏菜单中的"图像"并选择"裁剪"。使用矩形选择工具，绘制感兴趣的区域。两个裁剪的图像将单独显示。
接下来，取消同步两个窗口。如果未创建蒙版，则使用选择工具和裁剪绘制感兴趣的区域。之后，将视频保存为目录 Videosec 中的图像序列。
然后选择多通道图像，转到菜单中的插件，然后选择分段编辑器打开分段编辑器插件。选择徒手选择工具，并用它来选择绿色标签并设计最外层的蒙版。设计完成后，按复合窗口选择选项中的 Plus 按钮，所选蒙版将显示在查看器上。
对所有标签重复此步骤。设计所有掩码后，将蒙版保存为与视频相同的文件名，名称为：掩.tif。打开 MATLAB 并将 uTrack 目录添加到路径，通过去设置路径，并选择添加。
然后，将工作目录更改为包含要分析的系列的目录。通过在控制台中键入影片选择器 GUI 并按 Enter 来调用 uTrack。这将打开影片选择窗口。
按"新影片"按钮，等待"影片添加"窗口出现。按"添加通道"可选择包含视频的目录并填写影片信息参数。将 uTrack 结果的输出目录设置为结果，然后按"高级通道设置"，填写与采集相关的参数并保存。
创建影片后，在影片选择窗口中按"继续"。在这里，uTrack 将询问要分析的对象类型。选择"单个粒子"，然后将显示控制面板窗口。
接下来，选择第一步，步骤1：检测，然后单击"设置"。将显示"设置高斯混合模型拟合"窗口。输入此处所示的设置，然后按"应用"。
在控制面板中，单击"运行"以运行检测步骤。几分钟后，按"结果"按钮检查结果。影片在检测到的粒子上显示红色圆圈。
如果未显示红色圆圈，则此步骤无法正常工作，应重试。现在，通过首先设置参数，将刚刚检测到的粒子合并到跨越多个帧的轨道中，如下所示。然后在控制面板中按"运行"。
接下来，执行跟踪分析。定义设置，如下所示，然后按"应用"和"运行"。通过先按"结果"按钮来验证结果，然后单击"影片选项的显示轨道编号"窗口，然后按帧检查每个轨道是否已正确识别，手动标记不是真实粒子的粒子。
在 MATLAB 中，输入如下所示的命令。此命令将导致程序读取所有轨迹并计算扩散系数。接下来，通过提供要排除的点列表来排除与错误识别的点或轨迹对应的轨迹。
在随附的文本协议中遵循，计算该单元格每个轨道的瞬时扩散系数。在这种情况下，计算时差等于 D1 到 4 的扩散系数。完成后，将轨迹分解为短而长的轨迹。
要分析长轨迹，请键入此处所示的命令，通过运动时数缩放频谱对运动类型进行分类。分析每个粒子沿着其轨迹的强度。在随附的文本协议中遵循以下方法，以许多不同的方式配置此基本行为。
然后，收集所有轨迹的扩散和强度信息。只收集短轨迹的扩散和强度信息。最后，通过键入以下内容来收集时数频谱缩放和强度信息，其中长是以前使用的后缀。
使用本协议中描述的技术，可以自动跟踪荧光显微镜电影中检测到的粒子，并分析其动态特性。通过此分析，可以根据刺激的变化获得不同的特征。这包括，基于四个不同刺激的不可移动点的百分比，大于 50 帧的长轨迹的百分比，以及通过定向、自由或封闭运动分解的轨迹移动类型。
此外，还可以确定扩散系数、平均点强度和每个粒子的受体数量。这显示了每个点对不同刺激的反应的短扩散系数值的分布。红线表示中值，此类似图表显示每个点沿其前 20 帧的均点强度，以响应相同的刺激。
同样，红线表示平均强度值。由于一个点的均值校正强度与该点中荧光蛋白的数量相关，因此可以直接计算每个粒子的受体数量，如下所示。MATLAB 是一种与大小写相关的编程语言。
您可以根据本协议中描述的变量名称更改变量名称，但请确保在命名中保持一致。无法更改函数的名称，逗号、冒号和分号对于正确的语法非常重要。单分子显微镜允许以前所未有的时空分辨率可视化单个膜蛋白，并提供独特的机会，揭示细胞生物学的意外方面。
该协议为细胞和分子生物学中显微镜视频的定量分析打开了新的大门。
