Новые методы микроскопии требуют разработки адекватных инструментов для правильного понимания изучаемых биологических процессов. Этот протокол описывает шаги обработки изображений, необходимые для одноямекулярного слежения, включая оценку параметров боковой диффузии и количественную оценку размера пятна по всей его траектории на клеточной мембране. Этот протокол сочетает в себе использование нескольких программных частей, в том числе ImageJ, MATLAB и uTrack, а также некоторые белки, которые были разработаны специально для этого протокола.
Этот метод иллюстрируется с отслеживанием мембранных рецепторов под световой микроскопией, но он может быть применен к любой структуре, похожей на частицы, траектории которой можно отслеживать с течением времени в видеоряде. Этот метод относится к фундаментальным исследованиям и не имеет прямого применения в клинических условиях. Тем не менее, он может быть использован для оказания помощи в характеристике биологических событий как при различных заболеваниях, так и, следовательно, в выявлении новых терапевтических целей.
Этот протокол актуален для отслеживания частиц в клеточных мембранах, как показано на этом видео, но он также может быть применен для отслеживания полных клеток, бактерий, наночастиц в жидкости, или какой бы другой объект, центр которого может быть хорошо определен. Этот протокол является удобным для пользователя и требует только знания клеточной культуры и методов микроскопии. Различные методы и средства информатики, используемые в этом протоколе, могут запугать нового пользователя.
Визуальная демонстрация помогает использовать эту технику с уверенностью. Для начала выращивайте клетки юрката, трансфицировать их мономерным вектором рецепторов хемокина с маркировкой GFP, и отбирайте клетки с низким уровнем экспрессии обозначенного вектора, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Добавить средства массовой информации, содержащие CXCL12 лиганд или средства управления для каждого фибронектина покрытием 35-миллиметровый стеклянный дно микроуровн блюда, которые были покрыты фибронектином, и инкубировать в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию.
Затем добавьте отсортированные клетки к каждому блюду и инкубировать в течение 20 минут до визуализации клеток. После инкубации перенесите первое блюдо клеток на стадию микроскопа TIRF и поверните к цели 100-х нефтяного погружения. Найдите и сосредоточьтесь на клетках, используя яркое поле, чтобы свести к минимуму эффекты фотоотвечивания.
Затем переключитесь в режим TIRF и выполните корректировку тонкой фокусировки с использованием низкой интенсивности лазера. Приобретайте фильмы длиной около 50 секунд, минимизируя интервал времени между кадрами. Для каждого экспериментального видео файла состояния создайте новую папку в соответствии с указаниями структуры файлов, описанными в текстовом протоколе этого видео.
Откройте видео с Фиджи или ImageJ, перетащив и сбросив файл на бар меню Фиджи, и нажмите на OK для импорта файла LIF с использованием биоформатов. Для того, чтобы спроектировать маску, также импортируют соответствующее многоканайное изображение. Далее создайте маску, сначала создав единое изображение с каналами, полезными для дизайна маски.
Выберите изображение в меню бара и щелкните Color, а затем разделите каналы, чтобы показать различные каналы в качестве отдельных изображений. Сливать снова три канала в одном изображении, выбрав изображение в меню бара, переходя к цвету, и выбрав каналы слияния. Убедитесь в том, чтобы выбрать соответствующие каналы, а затем нажмите OK для создания нового не-сложенного изображения.
Синхронизируйте два окна, заехав в меню бара, выбрав Анализ, а затем переехав в Tools и выбрав Sync Windows. Будет показано новое окно с возможностями синхронного изображения. Теперь, когда два окна синхронизированы, один и тот же регион в обоих окнах может быть обрезан.
Перейдите к изображению в меню бара и выберите Crop. С помощью прямоугольного инструмента отбора нарисуйте область интереса. Два обрезанных изображения будут показаны индивидуально.
Далее, раздвоить оба окна. Если маска не была создана, нарисуйте область интереса инструментом отбора и урожаем. После этого сохраните видео в качестве последовательности изображений в каталоге Videosec.
Затем выберите многоканальную изображение, перейдите в Plugins в меню и выберите редактор сегментации, чтобы открыть плагин редактора сегментации. Выберите инструмент выбора от руки, и использовать его, чтобы выбрать зеленую этикетку и дизайн внешней маски. После его запуска нажмите кнопку Plus в опции выбора композитного окна, а выбранная маска будет отображаться на зрителе.
Повторите этот шаг для всех меток. После того, как все маски разработаны, сохранить маску с тем же именем файла, как видео, с именем:mask.tif. Откройте MATLAB и добавьте каталог uTrack на путь, отоберите Путь и выбрав Add With.
Затем измените Рабочий каталог на каталог, содержащий серию, которая будет проанализирована. Вызовите uTrack, введя графический интерфейс movie Selector в консоли и нажав на Enter. Это приведет к тому, что окно выбора фильма будет открыто.
Нажмите на кнопку «Новый фильм» и подождите, пока появится окно Movie Addition. Нажмите на Add Channel, чтобы выбрать каталог с видео и заполнить параметры информации о фильме. Установите каталог вывода для результатов uTrack к результатам, затем нажмите на Расширенные настройки канала, заполните параметры, связанные с приобретением, и сохраните.
После создания фильма, нажмите на Продолжить в окне выбора фильма. Здесь uTrack спросит о типе объекта, который будет проанализирован. Выберите одиночные частицы, и тогда появится окно панели управления.
Далее выберите первый шаг, шаг 1: Обнаружение, и нажмите на настройки. Появится окно установки гауссийской модели mixture Fitting. Введите настройки, как показано здесь, а затем нажмите Применить.
В панели управления нажмите на Run, чтобы выйти на шаг обнаружения. Через несколько минут проверьте результаты, нажав кнопку Результат. В фильме показаны красные круги на обнаруженных частицах.
Если красный круг не отображается, то этот шаг не сработал правильно, и вы должны попробовать еще раз. Теперь, объединить частицы, которые были только что обнаружены в треки, которые охватывают несколько кадров, сначала настройка параметров, как показано здесь. Затем нажмите Run в панели управления.
Далее выполните трек-анализ. Определите настройки, как показано здесь, а затем нажмите Применить и запустить. Проверьте результаты, сначала нажав на кнопку Результат, а затем нажмите на Show Track Номер окна вариантов фильма и проверить кадр за кадром, что каждый трек был правильно идентифицирован, вручную маркировки частиц, которые не являются истинными частицами.
В MATLAB введите команду, как показано здесь. Эта команда приведет к тому, что программа прочитает все траектории и вычислит коэффициенты диффузии. Далее исключите траектории, соответствующие неправильно идентифицированным пятнам или траекториям, давая список пятен для исключения.
Рассчитайте коэффициенты мгновенной диффузии для каждого из треков этой ячейки, следуя вместе в сопроводительном текстовом протоколе. В этом случае вычислить коэффициент диффузии для времени-лаг равен 4 называется D1 до 4. После завершения разложите траектории на короткие и длинные траектории.
Чтобы проанализировать длинные траектории, ввемите команду, показанную здесь, чтобы классифицировать тип движения через их спектр масштабирования момента. Проанализируйте интенсивность каждой частицы по их траектории. Настройте это базовое поведение по-разному, следуя в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем соберите информацию о диффузии и интенсивности для всех траекторий. Соберите только информацию о диффузии и интенсивности для коротких траекторий. Наконец, соберите момент масштабирования спектра и интенсивность информации, введя следующее, где долго суффикс используется ранее.
Использование методов, описанных в этом протоколе, позволяет осуществлять автоматизированное отслеживание частиц, обнаруженных в флуоресцентных микроскопических фильмах, и анализ их динамических характеристик. Из этого анализа можно получить различные характеристики, основанные на вариациях стимулов. Это включает в себя процент неподвижных пятен на основе четырех различных стимулов, процент длинных траекторий более 50 кадров, а также типы движения по траекториям, разбитым направленными, свободными или ограниченными движениями.
Кроме того, можно определить коэффициент диффузии, средние интенсивности пятна и количество рецепторов на частицу. Это показывает распределение значений короткого коэффициента диффузии для каждого места в ответ на различные стимулы. Красная линия представляет среднее значение, этот аналогичный график показывает средние интенсивности пятна для каждого пятна вдоль его первых 20 кадров в ответ на те же стимулы.
Опять же, красная линия представляет среднее значение интенсивности. Поскольку средняя скорректированная интенсивность пятна связана с количеством флуоресцентных белков, присутствующих в этом месте, можно непосредственно рассчитать количество рецепторов на частицу, как показано здесь. MATLAB — это чувствительный к делу язык программирования.
Вы можете изменять переменные имена по отношению к тем, которые описаны в этом протоколе, но не забудьте быть последовательными в своем названии. Названия функций не могут быть изменены, и запятые, толстой кишки, и полу-колонов имеют важное значение для правильного синтаксиса. Одномолекулярная микроскопия позволяет визуализировать отдельные мембранные белки с беспрецедентным пространственно-временным разрешением и предоставляет уникальные возможности для выявить непредвиденные аспекты клеточной биологии.
Эти протоколы открывают новые двери для количественного анализа видео микроскопии в клетках и молекулярной биологии.
