Las nuevas técnicas de microscopía requieren el desarrollo de herramientas adecuadas para la correcta comprensión de los procesos biológicos que se estudian. Este protocolo describe los pasos de procesamiento de imágenes necesarios para el seguimiento de una sola molécula, incluida la estimación de los parámetros de difusión lateral y la cuantificación del tamaño del punto sobre toda su trayectoria en la membrana celular. Este protocolo combina el uso de varias piezas de software, incluyendo ImageJ, MATLAB y uTrack, así como algunas proteínas que han sido desarrolladas específicamente para este protocolo.
Este método se ilustra con el seguimiento de los receptores de membrana bajo microscopía de luz, pero se puede aplicar a cualquier estructura similar a partículas cuyas trayectorias se pueden rastrear a lo largo del tiempo en una secuencia de vídeo. Esta técnica se relaciona con la investigación básica y no tiene aplicación directa en un entorno clínico. Sin embargo, se puede utilizar para ayudar en la caracterización de eventos biológicos tanto en diferentes enfermedades como, por lo tanto, en la identificación de nuevas dianas terapéuticas.
Este protocolo es relevante para el seguimiento de partículas en membranas celulares, como se muestra en este video, pero también se puede aplicar para el seguimiento de células completas, bacterias, nanopartículas en un fluido, o cualquier otro objeto cuyo centro pueda estar bien determinado. Este protocolo es fácil de usar y sólo requiere conocimientos de cultivo celular y técnicas de microscopía. Las diferentes técnicas y herramientas informáticas empleadas en este protocolo pueden intimidar a un nuevo usuario.
La demostración visual ayuda a utilizar esta técnica con confianza. Para empezar, las células de Jurkat, transfectándolas con un vector receptor de chemokina monomérico con etiqueta GFP, y seleccione las células con niveles de expresión bajos del vector etiquetado, como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña. Agregue medios que contengan el ligando CXCL12 o medios de control a cada microposobro recubierto de fibronectina de 35 milímetros que hayan sido recubiertos con fibronectina, e incubar durante una hora a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue las células ordenadas a cada plato e incubar durante 20 minutos antes de tomar imágenes de las células. Después de la incubación, transfiera el primer plato de células a una etapa del microscopio TIRF y déjese pasar al objetivo de inmersión de aceite 100x. Localice y concéntrese en las celdas utilizando el campo brillante para minimizar los efectos de fotoblancha.
A continuación, cambie al modo TIRF y realice un ajuste de enfoque fino utilizando una intensidad láser baja. Adquiere películas de aproximadamente 50 segundos de duración, minimizando el intervalo de tiempo entre fotogramas. Para cada archivo de vídeo de condición experimental, cree una nueva carpeta siguiendo las instrucciones de la estructura de archivos descritas en el protocolo de texto de este vídeo.
Abra el vídeo con Fiji o ImageJ arrastrando y soltando el archivo en la barra de menús de Fiji, y haga clic en Aceptar para importar el archivo LIF utilizando bioformatos. Para diseñar una máscara, también importe la imagen multicanal correspondiente. A continuación, cree una máscara creando primero una sola imagen con los canales útiles para el diseño de la máscara.
Seleccione Imagen en el menú de la barra y haga clic en Color seguido de Canales divididos para mostrar los diferentes canales como imágenes independientes. Combina de nuevo los tres canales de una sola imagen seleccionando Imagen en el menú de la barra, yendo a Color y seleccionando Combinar canales. Asegúrese de seleccionar los canales adecuados y, a continuación, pulse OK para generar una nueva imagen no apilada.
Sincronice las dos ventanas yendo al menú de la barra, seleccionando Analizar y, a continuación, vaya a Herramientas y seleccionando Sincronizar Windows. Se mostrará una nueva ventana con las posibilidades de imagen sincronizada. Ahora, con las dos ventanas sincronizadas, se puede recortar la misma región en ambas ventanas.
Vaya a Imagen en el menú de la barra y seleccione Recortar. Con la herramienta de selección rectangular, dibuje la región de interés. Las dos imágenes recortadas se mostrarán individualmente.
A continuación, desincronice ambas ventanas. Si no se ha creado ninguna máscara, dibuje la región de interés con la herramienta de selección y el recorte. Después de eso, guarde el vídeo como una secuencia de imágenes en el directorio Videosec.
A continuación, seleccione la imagen multicanal, vaya a Plugins en el menú y seleccione Editor de segmentación para abrir el plugin del editor de segmentación. Elija la herramienta de selección a mano alzada y utilícela para seleccionar una etiqueta verde y diseñar la máscara más externa. Una vez diseñado, pulse el botón Plus en la opción de selección de la ventana compuesta, y la máscara seleccionada se mostrará en el visor.
Repita este paso para todas las etiquetas. Una vez que todas las máscaras están diseñadas, guarde la máscara con el mismo nombre de archivo que el video, con el nombre:mask.tif. Abra MATLAB y agregue el directorio uTrack a la ruta de acceso yendo a Establecer ruta y seleccionando Agregar con.
A continuación, cambie el Directorio de trabajo al directorio que contiene la serie que se va a analizar. Invoque uTrack escribiendo Movie Selector GUI en la consola y presionando Intro. Esto hará que se abra la ventana de selección de película.
Pulse el botón Nueva película y espere a que aparezca la ventana Adición de película. Pulse en Añadir canal para elegir el directorio con el vídeo y rellenar los parámetros de información de la película. Establezca el directorio de salida para los resultados de uTrack en Results y, a continuación, pulse en Configuración avanzada de canal, rellene los parámetros relacionados con la adquisición y guárdelos.
Después de crear la película, pulse en Continuar en la ventana de selección de película. Aquí, uTrack preguntará sobre el tipo de objeto a analizar. Elija Partículas únicas y, a continuación, aparecerá la ventana del panel de control.
A continuación, seleccione el primer paso, Paso 1: Detección, y haga clic en Configuración. Aparecerá la ventana Configuración de la aplicación del modelo de mezcla gaussiana. Ingrese los ajustes como se muestra aquí, y después presione aplicar.
En el panel de control, haga clic en Ejecutar para ejecutar el paso de detección. Después de unos minutos, compruebe los resultados pulsando el botón Resultado. La película muestra círculos rojos en las partículas detectadas.
Si no se muestra ningún círculo rojo, este paso no ha funcionado correctamente y debe intentarlo de nuevo. Ahora, combine las partículas que se acaban de detectar en pistas que abarcan varios fotogramas configurando primero los parámetros como se muestra aquí. A continuación, pulse Ejecutar en el panel de control.
A continuación, realice análisis de pista. Defina la configuración, como se muestra aquí, y luego presione Aplicar y ejecutar. Verifique los resultados pulsando primero en el botón Resultado y, a continuación, haga clic en Mostrar número de pista de la ventana de opciones de película y compruebe fotograma a fotograma que cada pista se ha identificado correctamente, marcando manualmente partículas que no son partículas verdaderas.
En MATLAB, ingrese el comando como se muestra aquí. Este comando hará que el programa lea todas las trayectorias y calcule los coeficientes de difusión. A continuación, excluya las trayectorias correspondientes a puntos o trayectorias identificados incorrectamente dando la lista de puntos a excluir.
Calcule los coeficientes de difusión instantáneos para cada una de las pistas de esta celda siguiendo el protocolo de texto adjunto. En este caso, calcular el coeficiente de difusión para un time-lag es igual a 4 llamado D1 a 4. Cuando haya terminado, descomponga las trayectorias en trayectorias cortas y largas.
Para analizar trayectorias largas, escriba el comando como se muestra aquí para clasificar el tipo de movimiento a través de su espectro de escala de momento. Analizar la intensidad de cada partícula a lo largo de su trayectoria. Configure este comportamiento básico de muchas maneras diferentes siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña.
A continuación, recopile la información de difusión e intensidad para todas las trayectorias. Reunir sólo la información de difusión e intensidad para trayectorias cortas. Por último, recopile el momento de escalado del espectro y la información de intensidad escribiendo lo siguiente, donde long es el sufijo utilizado anteriormente.
El uso de las técnicas descritas en este protocolo permite el seguimiento automatizado de partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. A partir de este análisis, se pueden obtener diferentes características basadas en variaciones en los estímulos. Esto incluye, el porcentaje de puntos inmóviles basados en cuatro estímulos diferentes, el porcentaje de trayectorias largas de más de 50 fotogramas y los tipos de movimiento a lo largo de las trayectorias según lo descomodado por movimientos dirigidos, libres o confinados.
Además, se puede determinar el coeficiente de difusión, las intensidades medias del punto y el número de receptores por partícula. Esto muestra la distribución de los valores de coeficiente de difusión cortos para cada punto en respuesta a diferentes estímulos. La línea roja representa el valor medio, este gráfico similar muestra las intensidades de punto media para cada punto a lo largo de sus primeros 20 fotogramas en respuesta a los mismos estímulos.
Una vez más, la línea roja representa el valor de intensidad media. Como la intensidad corregida media de un punto está relacionada con el número de proteínas fluorescentes presentes en este punto, se puede calcular directamente el número de receptores por partícula, como se muestra aquí. MATLAB es un lenguaje de programación que distingue mayúsculas de minúsculas.
Puede variar los nombres de las variables con respecto a los descritos en este protocolo, pero asegúrese de ser coherente en su nomenclatura. Los nombres de las funciones no se pueden cambiar y las comas, los dos puntos y los punto y coma son importantes para una sintaxis correcta. La microscopía de una sola molécula permite la visualización de proteínas de membrana individuales con una resolución espacio-temporal sin precedentes y proporciona oportunidades únicas para revelar aspectos imprevistos de la biología celular.
Estos protocolos abren nuevas puertas para el análisis cuantitativo de videos de microscopía en células y biología molecular.
