念珠菌是免疫功能低下宿主中传播真菌感染的最常见原因。由于基质，治疗剂未能完全渗入生物膜是生物膜抵制传统疗法的一个原因。我们的协议评估光疗，使用红灯，如何干扰念珠菌生物膜的生长和排列。
由于本研究采用的菌株具有细胞外基质特征，光器件已成功应用于其他浮游微生物悬浮液和生物膜，因此应用的方法已很成熟。该设备的最大优点是缩短治疗时间，使其在临床应用中更加明显。当培养念念者时，人们意识到抗体是可以获得的。
因此，重要的是不要使用超过七天的菌落，不要在摄氏四度时启动板块，也不要从现有板块中重新感染细胞。同样，应变应在18小时的夜间生长前使用。首次使用分光光度计时，首先获得单位计数的聚落农场与光学密度值相关非常重要。
因此，实验将开始使用生长期的中间，初始细胞浓度为每毫升10至7个细胞。这种细胞浓度已被证明提供最依赖和稳定物质生物膜。首先，在1000毫升蒸馏水中悬浮65克SDA，每升加50毫克氯霉素。
将烧杯放在加热器上煮沸，以便完全溶解介质。然后将介质转移到玻璃瓶中。将瓶盖放在瓶子上，但不要完全拧下，以确保瓶子能够通风。
将瓶子放在自风车中，在 15 PSI 和 121 摄氏度下对溶液进行消毒 30 分钟。将溶液冷却至 45 摄氏度左右。使用一次性的无菌移液器，将20毫升SDA和移液器混合到无菌培养板中。
准备 YNB 介质，辅以 100 毫摩尔葡萄糖，将 6.7 克 YNB 和 18 克葡萄糖混合到 1000 毫升超纯水杯中。在烧杯中放置搅拌棒，将烧杯放在搅拌盘上混合。通过 0.22 微米真空过滤器系统过滤介质以进行灭菌。
将 10.4 克 RPMI-1640 和 34 克 MOPS 混合到 1，000 毫升超纯水，准备 RPMI 介质。在没有热量的情况下混合搅拌器，通过添加一个正常的氢氧化钠将PH调整为7。使用 0.22 微米真空过滤器系统对介质进行灭菌。
首先，在环境温度下解冻微生物念珠菌SN 425。种子 10 微升停止培养在以前准备的含有 SDA 的培养皿上， 辅以氯霉素。在37摄氏度下有氧孵育培养培养皿48小时。
对于预孵化使用灭菌润滑油从培养皿中挑选10个念珠菌群，并放入含有10毫升YNB介质的离心管中，并辅以葡萄糖。在37摄氏度下有氧孵育管，16小时。然后，准备接种，通过添加这种启动培养到新鲜的YNB培养，辅以葡萄糖，在1至10比例稀释。
使用分光光度计测量 540 纳米的初始 OD。在37摄氏度下有氧孵育接种8小时，在540纳米测量最终的OD。从初始 OD 中减去最终 OD，以检查接种的 OD 是否处于中日志生长阶段。
为了获得每毫升10至7个细胞的入联，将进心机离心5分钟，达到5，500倍G.将上流液倒入含有次氯酸钠的烧杯中，并加入新鲜的YNB，将进一定能浓缩到上一体积的一半。在24孔聚苯乙烯板的每个孔中加入一毫升的加入。在37摄氏度下有氧孵育90分钟，使细胞粘附在井底。
用一毫升0.12%氯己酸对照生物膜处理生物膜一分钟。对于阴性控制，用一毫升无菌，0.89%氯化钠处理生物膜一分钟。随后，洗井两次，每洗一分钟，用一毫升无菌0.89%氯化钠去除非粘附细胞。
然后打开非相干红光，并使用功率计测量光的功率密度。根据每平方厘米 87.6 焦耳的能量密度要求确定曝光时间。将盘子放在红灯下。
将光源和生物膜之间的距离保持到五毫升，以避免使样品变暖。暴露一分钟后，将消毒的RPMI介质加入一毫升，并在夜间37摄氏度下孵育。在早上，重复相同的洗涤，光处理，正负控制治疗，并孵育6小时与RPMI介质。
再次，清洗生物膜两次，使其暴露在红灯下，并执行正负控制处理。在油井中吸进溶液并添加 RPMI 介质。重复孵育、洗涤、光处理和正负控制处理，直到实现48小时的生物膜发育。
要开始加工，请丢弃介质，将一毫升无菌、0.89%氯化钠加入井中，并使用移液器尖端从井中刮出生物膜。将去除的生物膜转移到无菌管中。再加一毫升无菌，0.89%氯化钠到井里。
再次划伤它，并添加悬架到同一管，总体积为2毫升。大力涡旋生物膜悬浮一分钟。在 CFU 分析中，将 0.1 毫升的等分从生物膜悬浮液转移到微离心管中，该管包含 900 微升的 0.89% 氯化钠溶液，每次稀释。
在盐水溶液中，将生物膜溶液从10稀释到负片溶液，稀释至负4。种子50微升每次稀释到SDA板，并在37摄氏度孵育板48小时。计算殖民地并应用公式。
对于干重量分析，首先称重并标记微型离心管。将0.1毫升的生物膜悬浮液和1毫升绝对乙醇加入管中，并在负20摄氏度下储存18小时。然后，将10，000次G离心10分钟。
丢弃上流液，将管子放在干燥器中干燥样品一周。再次称重微离心管，并做减法以获得生物量重量。在这个实验中，与用氯化钠处理的负对照相比，用红灯进行一分钟的每死/量治疗后，CFU被减少。
每日治疗后，Candida albicans生物膜的生物量结果显示，红光处理组的生物量与正对照组（用氯己海丁）观察到的生物量相似。这两组人之间的统计相似度也不同。虽然两者都显示生物量减少，相比使用氯化钠处理的负对。
与负控制相比，在正对中观察到低量的念珠菌可溶性和不溶性EPS。即使统计学上没有显著性，红光的日用应用在数值上减少了 EPS 可溶性和 EPS 不溶性量。负对照组与红光处理组，表现出统计相似性。
测量光的功率密度，在开始处理之前使用功率计来确定确切的应用周期。这些步骤可确保能量密度始终为每厘米 87.6 焦耳/ 平方。使用前面引用的公式。
测量使用相同的光到板瓶，五毫米。可以研究光疗和抗真菌药物之间的关联，以检查使用红灯的预处理，然后进行药物应用，是否改善了药物对生物膜的渗透。对于每天两次的治疗，我们调整了实验室的协议，提供了一个简单且可重复的生物膜模型，在红灯处理后，该模型提供了有关生存能力、干重和细胞外多糖量的答案。
该协议是通用的，可用于测试其他疗法，除了红灯，包括药物，其他灯，或光和药物的组合。与微生物一起工作需要特殊设备，如安全眼镜、纽扣实验室外套和硝基手套。
