Candida immünosyonlu konaklarda yaygın mantar enfeksiyonunun en sık nedenidir. Terapötik ajanların matris yüzünden biyofilme tam olarak sızmaması, biyofilmlerin geleneksel tedavilere direnmesinin nedenlerinden biridir. Protokolümüz, kırmızı ışıkta kullanarak fototerapinin Candida albicans biyofilmlerinin büyümesini ve düzenlenmesini nasıl etkilediğini değerlendiriyor.
Bu çalışmada kullanılan gerinim in hücre dışı matriks karakterize olduğundan ve ışık cihazı diğer planktonik mikroorganizma süspansiyonlarına ve biyofilmlere başarıyla uygulandığından, uygulanan yöntemler iyi belirlenmiştir. Bu cihazın en büyük avantajı tedavi süresinin azalmasıdır, bu da onu klinik uygulamalar için daha görünür hale getirir. Candida albicans culturing zaman antikorlar elde edilebilir farkında olun.
Bu nedenle, yedi günden eski koloniler kullanmamak, plakaları dört santigrat derecede başlatmamak ve mevcut plakalardan hücreleri yeniden çizgile mesken etmemek önemlidir. Aynı şekilde, bir gerginlik bir gecede büyüme 18 saat önce kullanılmalıdır. İlk kez bir spektrofotometre kullanırken, optik yoğunluk değerleri ile ilişkilendirmek için, ilk birim sayıları koloni çiftlik elde etmek önemlidir.
Bu nedenle, deneyler mililitre başına 10 ila yedi hücrenin ilk hücre konsantrasyonunda büyüme fazının ortasını kullanmaya başlayacaktır. Bu hücre konsantrasyonunun en bağımlı ve kararlı madde biyofilmlerini sağladığı gösterilmiştir. Başlamak için, SDA 65 gram askıya, Kloramphenicol litre başına 50 miligram ile takviye, içinde 1, bir kabın distile su mililitre.
Orta yıtamamen eritmek için kabı kaynamak için bir ısıtıcının üzerine yerleştirin. Sonra bir cam şişe için medya aktarın. Şişe üzerine kapağı yerleştirin, ama şişe havalandırma yapabiliyor sağlamak için tamamen vida yok.
Çözeltiyi 15 PSI ve 121 santigrat derecede 30 dakika sterilize etmek için şişeyi bir otoklava yerleştirin. Yaklaşık 45 santigrat derece ye kadar çözeltiyi soğutun. İyi karıştırmak için tek kullanımlık, steril pipet ve steril Petri plakaları içine SDA 20 mililitre pipet kullanın.
YNB orta hazırlamak için, 100 milimolar glikoz ile takviye, mix 6.7 YNB gram ve dekstroz 1, bir beher ultra saf su mililitre 18 gram. Kabın içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırmak için bir karıştırmak için bir karıştırma kayış üzerine beher koyun. Sterilize etmek için ortamı 0,22 mikrometrelik vakum filtre sisteminden filtreleyin.
RPMI-1640 10,4 gram ve MOPS 34 gram karıştırarak RPMI orta hazırlayın, ultra saf su 1.000 mililitre. Isı olmadan bir karıştırıcı karıştırın ve normal bir sodyum hidroksit ekleyerek PH yedi ayarlayın. 0,22 mikrometrevakum filtre sistemi kullanarak ortamı sterilize edin.
İlk olarak, ortam sıcaklığında Mikroorganizma Candida albicans SN 425 çözülme. Kloramfenikol ile desteklenen, Daha önce hazırlanmış SDA içeren Petri kapları üzerinde stop kültürünün 10 mikrolitre tohum. Petri yemeklerini aerobik olarak 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.
Pre-inoculum için Petri kaplarından Candida albicans 10 kolonileri almak ve 10 ynb orta mililitre içeren bir santrifüj tüp içine yerleştirin steril bir madeni kullanın, glikoz ile birlikte. Tüpü aerobik olarak 37 derecede 16 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, taze YNB orta içine bu başlangıç kültürü ekleyerek inoculums hazırlamak, glikoz ile desteklenen, seyreltme için bir ila 10 oranında.
540 nanometre de ilk OD ölçmek için spektrofotometre kullanın. Inokülleri aerobik olarak 37 santigrat derecede sekiz saat kuluçkaya yatırın ve son OD'yi 540 nanometrede ölçün. İnoküllerin OD'sinin orta günlük büyüme aşamasında olup olmadığını kontrol etmek için ilk OD'den son OD'yi çıkarın.
Mililitre başına yedi hücreye 10 tane bir inokül elde etmek için, inoculumu 5 dakika 5,500 kez G.'de sentrifuge sodyum hipoklorit içeren bir kabın içine dökün ve inoculumu önceki hacmin yarısına yoğunleştirmek için taze YNB ekleyin. 24 kuyu polistiren plakanın her kuyuya bir mililitre inokül ekleyin. 37 derecede 90 dakika boyunca aerobik olarak kuluçkaya yatırın ve hücrenin kuyuların dibine yapışmasını bekleyin.
Pozitif kontrol biyofilmleri için biyofilmleri bir mililitre %0.12 klorheksidin ile bir dakika tedavi edin. Negatif kontrol için, bir dakika boyunca biyofilmleri bir mililitre steril, %0.89 sodyum klorür ile tedavi edin. Daha sonra, yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için steril 0,89% sodyum klorür bir mililitre ile, iki kez, bir dakika her kuyuyı yıkayın.
Daha sonra tutarlı olmayan bir kırmızı ışığı açın ve ışığın güç yoğunluğunu ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Santimetre kare başına 87,6 joule enerji yoğunluğu gereksinimine göre pozlama süresini belirleyin. Plakayı kırmızı ışığın altına yerleştirin.
Numunenin ısınmasını önlemek için ışık kaynağı ile biyofilm arasındaki mesafeyi beş mililitreye kadar tutun. Bir dakika maruz kaldıktan sonra, her kuyuya bir mililitre sterilize RPMI ortamı ekleyin ve tabakları gece boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sabahları, rpmi orta ile altı saat boyunca aynı yıkama, ışık tedavisi, pozitif ve negatif kontrol tedavileri ve kuluçka tekrarlayın.
Yine, biyofilmleri iki kez yıkayın, kırmızı ışığa maruz kınıyor ve pozitif ve negatif kontrol uygulamaları yapın. Kuyularda çözelti aspire ve RPMI orta ekleyin. 48 saatlik biyofilm gelişimine ulaşana kadar kuluçka, yıkama, ışık tedavisi ve pozitif ve negatif kontrol tedavilerini tekrarlayın.
Işleme başlamak için, orta atın ve steril bir mililitre ekleyin, kuyuya% 0.89 sodyum klorür, ve kuyudan biyofilm çizik için bir pipet ucu kullanın. Çıkarılan biyofilmi steril bir tüpe aktarın. Bir mililitre steril, %0.89 sodyum klorür daha ilave edin.
Tekrar çizin ve aynı tüp için süspansiyon ekleyin, 2 mililitre toplam hacmi için. Bir dakika lığına biyofilm süspansiyonuna şiddetle girdap. CFU analizi için, biyofilm süspansiyonundan her seyreltme için %0,89 sodyum klorür çözeltisi içeren 900 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 0,1 mililitrelik bir aliquot aktarın.
Biyofilm çözeltisini 10'dan negatif e, 10'dan negatif dörde, tuzlu çözeltide seyreltin. SDA plakaları için her seyreltme 50 mikrolitre tohum ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece plakalar kuluçka. Kolonileri say ve formülü uygulayın.
Kuru ağırlık analizi için, ilk tartmak ve etiket mikro santrifüj tüpler. Tüplere 0,1 mililitre biyofilm süspansiyonu ve bir mililitre mutlak etanol ekleyin ve 18 saat boyunca negatif 20 santigrat derecede saklayın. Sonra, 10 dakika için 10,000 kez G santrifüj.
Supernatant atın ve bir hafta boyunca örnekleri kurutmak için bir kurutucu tüpler yerleştirin. Mikro santrifüj tüplerini tekrar tartın ve biyokütle ağırlığını elde etmek için çıkarma yapın. Bu deneyde, Candida albicans biyofilmbir dakika için kırmızı ışık ile diem tedaviler başına sonra, CFU sodyum klorür ile tedavi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, azaltıldı.
Candida albicans biyokütlesinin günlük tedaviler sonrası elde edilen sonuçları, kırmızı ışıktedavi edilen grubun klorheksidin ile tedavi edilen pozitif kontrol grubunda gözlenen biyokütlede benzer bir azalma gösterdiğini göstermektedir. İki grup da birbiriyle istatistiksel benzerlik gösterdi. Her ikisi de biyokütle azalma gösterdi iken, sodyum klorür ile tedavi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında.
Düşük miktarda Candida albicans çözünür ve çözünmez EPS, pozitif kontrol gözlendi, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da, kırmızı ışığın diem uygulaması başına eps çözünür ve EPS çözünmez miktarlarını sayısal olarak azalttı. Negatif kontrol ve kırmızı ışık tedavi grubu, istatistiksel benzerlik gösterdi.
Uygulamanın tam sürelerini belirlemek için tedaviye başlamadan önce bir güç ölçer kullanarak ışığın güç yoğunluğunu ölçmek. Bu adımlar, enerji yoğunluğunun her zaman santimetre karesi olan 87,6 joule olmasını garanti ediyor. Daha önce atıfta bulunulan formülü kullanın.
Ölçüm, ışıktan plakaşişesine kadar beş milimetre lik bir ölçüm le yapılır. Fototerapi ve antifungal ilaçlar arasındaki bir ilişki kırmızı ışık ile ön tedavi, ilaç uygulaması takip kontrol etmek için incelenebilir, biyofilm içine ilaç penetrasyonu artırır. Günde iki kez tedavi için, kırmızı ışık tedavisinden sonra canlılık, kuru ağırlık ve hücre dışı polisakkarit miktarları ile ilgili cevaplar veren kolay ve tekrarlanabilir biyofilm modeli sağlayarak laboratuvarımızın protokollerini uyarladık.
Protokol geneldir ve kırmızı ışığa ek olarak, ilaçlar, diğer ışıklar veya ışık ve ilaçların kombinasyonu da dahil olmak üzere diğer tedavileri test etmek için kullanılabilir. Mikroorganizmalarla çalışmak için güvenlik gözlükleri, düğme laboratuvar önlüğü ve nitro eldivenler gibi özel ekipmanlar gerekmektedir.
