Candida является наиболее распространенной причиной распространенной грибковой инфекции у иммунокомпромиссных хостов. Неспособность терапевтических агентов полностью проникнуть биопленки из-за матрицы является одной из причин, почему биопленки противостоять традиционной терапии. Наш протокол оценивает, как фототерапия, используя красный свет, препятствует росту и расположению биопленок Candida Albicans.
Применяемые методы хорошо известны, так как штамм, используемый в данном исследовании, имел свою внеклеточную матрицу, и световое устройство было успешно применено к другим планктонным подвескам и биопленким микроорганизмам. Наибольшее преимущество этого устройства является сокращение времени лечения, что делает его более заметным для клинических применений. При культивировании Candida albicans знать, что антитела могут быть приобретены.
Поэтому важно не использовать колонии, которые старше семи дней, не начинать пластины при четырех градусах Цельсия, и не перегоняя клетки из существующих пластин. Аналогичным образом, штамм следует использовать до 18 часов ночного роста. При использовании спектрофотометра впервые важно сначала получить колонию фермы в единицах рассчитывает, соотнести с оптическими значениями плотности.
Таким образом, эксперименты начнут использовать середину фазы роста в начальной концентрации клеток от 10 до 7 клеток на миллилитры. Было показано, что эта концентрация клеток обеспечивает наиболее зависимую и стабильную биопленку вещества. Для начала приостанавливаем 65 граммов ПДД, дополненного 50 миллиграммами на литр хлорамфеникол, в 1000 миллилитров дистиллированной воды в стакане.
Поместите стакан на нагреватель до кипения, для того, чтобы полностью растворить среду. Затем перенесите средства массовой информации в стеклянную бутылку. Поместите крышку на бутылку, но не винт его полностью, чтобы обеспечить бутылку в состоянии вентиляционные.
Поместите бутылку в автоклав для стерилизации раствора при 15 PSI и 121 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Охладить раствор до 45 градусов по Цельсию. Используйте одноразовые, стерильные пипетки, хорошо перемешать, и пипетки 20 миллилитров ПДД в стерильные пластины Петри.
Для приготовления среды YNB, дополненной 100 миллимолярной глюкозой, смешайте 6,7 грамма YNB и 18 граммов декстрозы до 1000 миллилитров ультра чистой воды в стакане. Поместите бар перемешать в стакан и положить стакан на тарелку перемешать, чтобы смешать. Фильтр среды через 0,22 микрометровый вакуумный фильтр системы для стерилизации.
Приготовьте RPMI medium, смешивая 10,4 грамма RPMI-1640 и 34 грамма MOPS, до 1000 миллилитров ультра чистой воды. Смешайте в мешалку без тепла и отрегулируйте PH до семи, добавив один нормальный гидроксид натрия. Стерилизовать среду с помощью 0,22 микрометровой вакуумной фильтровальной системы.
Во-первых, оттепель микроорганизм Candida Albicans SN 425 при температуре окружающей среды. Семена 10 микролитров стоп-культуры на ранее приготовленных чашках Петри, содержащих ПДД, дополненных хлорамфениколом. Инкубировать чашки Петри аэробико при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов.
Для предварительного инокулума используйте стерилизованную смазку, чтобы выбрать 10 колоний Candida albicans из чашек Петри и поместить их в центрифугу трубку, содержащую 10 миллилитров среды YNB, дополненную глюкозой. Инкубировать трубку аэробно при 37 градусах по Цельсию в течение 16 часов. Затем приготовьте инокулы, добавив эту культуру стартера в свежую среду YNB, дополненную глюкозой, в пропорции от одного до 10 для разбавления.
Используйте спектрофотометр для измерения первоначального OD на 540 нанометров. Инкубировать инокулы аэробико на 37 градусов по Цельсию в течение восьми часов, и измерить окончательный OD на 540 нанометров. Вычесть окончательный OD из первоначального OD, чтобы проверить, если OD инокулумов находятся на фазе роста среднего журнала.
Чтобы получить инокулум с 10 до 7 клеток на миллилитр, центрифуга инокулума в течение пяти минут при 5500 раз G.Pour супернатант в стакан, содержащий гипохлорит натрия и добавить свежий YNB, чтобы сконцентрировать инокулум до половины предыдущего объема. Добавьте один миллилитр инокулума к каждому колодец из 24 хорошо полистирол пластины. Инкубировать аэробно при 37 градусах по Цельсию в течение 90 минут, чтобы клеточное деление на дно колодцев.
Лечить биопленки в течение одной минуты с одним миллилитр 0,12%хлоргексидин для положительного контроля биопленки. Для отрицательного контроля, лечить биопленки в течение одной минуты с одним миллилитр стерильных, 0,89% хлорида натрия. Впоследствии, мыть скважины два раза, по одной минуте каждый, с одним миллилитр стерильных 0,89% хлорида натрия для удаления непритята клеток.
Затем включите несоключаемый красный свет и используйте счетчик мощности для измерения плотности мощности света. Определите время экспозиции на основе потребности в плотности энергии в 87,6 джоуля на квадратный сантиметр. Поместите тарелку под красный свет.
Держите расстояние между источником света и биопленкой до пяти миллилитров, чтобы избежать потепления образца. После воздействия в течение одной минуты, добавить один миллилитр стерилизованной RPMI среды для каждого хорошо, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение ночи. Утром повторите ту же стирку, легкое лечение, положительное и отрицательное контрольное лечение, и инкубацию в течение шести часов со средой RPMI.
Опять же, мыть биопленки в два раза, подвергать их красный свет, и выполнять положительные и отрицательные методы контроля. Аспирировать раствор в скважинах и добавить RPMI среды. Повторите инкубацию, стирку, легкую обработку, а также положительные и отрицательные методы контроля, до достижения 48 часов развития биопленки.
Чтобы начать обработку, отбросьте среду и добавьте один миллилитр стерильного, 0,89% хлорида натрия в колодец, и используйте наконечник пипетки, чтобы поцарапать биопленку из колодец. Перенесите удаленную биопленку в стерильную трубку. Добавьте еще один миллилитр стерильного, 0,89% хлорида натрия в колодец.
Поцарапайте его снова и добавьте подвеску к той же трубке, для общего объема 2 миллилитров. Энергично вихрь биопленки подвески в течение одной минуты. Для анализа CFU перенесите алицит 0,1 миллилитров из подвески биопленки в микро центрифугу, содержащую 900 микролитров раствора хлорида натрия 0,89% для каждого разбавления.
Разбавить раствор биопленки от 10 до отрицательного, до 10 до отрицательной четверки, в солевой раствор. Семя 50 микролитров каждого разбавления ПДД пластин, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов. Подсчитайте колонии и примените формулу.
Для анализа сухого веса сначала взвешивают и маркифицировать микро центрифуги. Добавьте 0,1 миллилитров биопленки подвески и один миллилитр абсолютного этанола в трубки, и хранить их при отрицательном 20 градусов по Цельсию в течение 18 часов. Затем центрифуга 10 000 раз G в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и поместите трубки в децикатор, чтобы высушить образцы в течение одной недели. Взвесить микро центрифуг трубки снова, и сделать вычитание, чтобы получить вес биомассы. В этом эксперименте, после лечения diem с красным светом в течение одной минуты, чтобы Candida albicans биопленки, CFU был сокращен, по сравнению с отрицательным контролем, обработанным хлоридом натрия.
Результаты биомассы биопленок Candida albicans после ежедневных процедур показывают, что группа, обработанная красным светом, представила аналогичное сокращение биомассы, наблюдаемое в положительной контрольной группе, обработанной хлоргексидином. Эти две группы также продемонстрировали статистическое сходство друг с другом. Хотя они оба показали снижение биомассы, по сравнению с отрицательным контролем, обработанным хлоридом натрия.
Низкое количество Candida albicans растворимых и нерастворимых EPS, наблюдалось в положительном контроле, по сравнению с отрицательным контролем. Несмотря на то, что это не является статистически значимым, применение красного света в расчете на красный свет численно уменьшило количество растворимых EPS и EPS нерастворимых. Отрицательный контроль и красный свет обработанной группы, показали статистическое сходство.
Измерение плотности мощности света, используя счетчик мощности перед началом лечения, чтобы определить точные периоды применения. Шаги гарантируют, что плотность энергии всегда будет 87,6 джоулей на сантиметр в квадрате. Используйте ранее приведенную формулу.
Измерение делается с использованием того же от света до бутылки пластин, пять миллиметров. Связь между фототерапией и противогрибковых препаратов могут быть изучены, чтобы проверить, если предварительное лечение красным светом, а затем применение препарата, улучшает проникновение наркотиков в биопленку. Для двухразовой ежедневной обработки мы адаптировали протоколы нашей лаборатории, обеспечивая легкую и воспроизводимую модель биопленки, которая дает ответы относительно жизнеспособности, сухого веса и внеклеточного количества полисахаридов после лечения красным светом.
Протокол является общим и может быть использован для тестирования других методов лечения, в дополнение к красный свет, в том числе наркотики, другие огни, или сочетание света и наркотиков. Работа с микроорганизмами требует специального оборудования, такого как защитные очки, кнопочные лабораторные пальто и нитро-перчатки.
