קנדידה היא הגורם השכיא ביותר לזיהום פטרייתי מופץ אצל מארחים immunocompromised. הכישלון של סוכנים טיפוליים לחדור באופן מלא biofilm בגלל המטריצה היא אחת הסיבות מדוע biofilms להתנגד טיפולים מסורתיים. הפרוטוקול שלנו מעריך כיצד פוטותרפיה, באמצעות אור אדום, מפריעה לצמיחה ולסידור של ביופילמים של קנדידה אלביקנים.
השיטות המיושמות מבוססות היטב, שכן הזן המשמש במחקר זה היה מטריצה חוץ תאית שלה מאופיין מכשיר האור הוחל בהצלחה על מתלים מיקרואורגניזם פלנקטוני אחרים biofilms. היתרון הגדול ביותר של מכשיר זה הוא צמצום זמן הטיפול, מה שהופך אותו גלוי יותר עבור יישומים קליניים. כאשר culturing קנדידה אלביקנים להיות מודעים לכך נוגדנים ניתן לרכוש.
לכן, חשוב לא להשתמש במושבות כי הם יותר משבעה ימים, לא להתחיל צלחות בארבע מעלות צלזיוס, ולא לפס מחדש תאים מן הלוחות הקיימים. כמו כן, יש להשתמש במתח לפני 18 שעות של צמיחה לילה. בעת שימוש בספקטרופוטומטר בפעם הראשונה חשוב להשיג תחילה חוות מושבה ביחידות ספירת, כדי לתאם לערכי צפיפות אופטית.
לכן, ניסויים יתחילו להשתמש באמצע שלב הצמיחה בריכוז התא הראשוני של 10 עד 7 תאים למיליליטר. ריכוז תאים זה הוכח לספק את הביופילמים החומר התלויים והיציבים ביותר. כדי להתחיל, להשעות 65 גרם של SDA, בתוספת 50 מיליגרם לליטר של כלוראמפניקול, ב 1, 000 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק.
מניחים את הסקילר על תנור לרתיחה, על מנת להמיס את המדיום לחלוטין. ואז להעביר את התקשורת לבקבוק זכוכית. מניחים את הכובע על הבקבוק, אבל לא לדפוק אותו לחלוטין כדי להבטיח את הבקבוק הוא מסוגל לפרוק.
מניחים את הבקבוק במקלבה אוטומטית כדי לעקר את הפתרון ב 15 PSI ו 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מצננים את הפתרון סביב 45 מעלות צלזיוס. השתמש חד פעמי, פיפטה סטרילית, כדי לערבב היטב, ו pipette 20 מיליליטר של SDA לתוך צלחות פטרי סטרילי.
כדי להכין בינוני YNB, בתוספת 100 גלוקוז מילימולר, לערבב 6.7 גרם של YNB ו 18 גרם של דקסטרוז ל 1, 000 מיליליטר של מים טהורים במיוחד בבקבוק. מניחים בר מערבבים בפקק ומכניסים את הסקילר לצלחת ערבוב כדי לערבב. סנן את המדיום באמצעות מערכת סינון ואקום של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר.
הכן מדיום RPMI על ידי ערבוב 10.4 גרם של RPMI-1640 ו 34 גרם של MOPS, ל 1, 000 מיליליטר של מים טהורים במיוחד. מערבבים תוך ערבוב ללא חום ומתאימים את ה-PH לשבעה על ידי הוספת נתרן הידרוקסידי רגיל אחד. יש לעקר את המדיום באמצעות מערכת סינון ואקום של 0.22 מיקרומטר.
ראשית, להפשיר את מיקרואורגניזם קנדידה אלביקנים SN 425 בטמפרטורת הסביבה. זרעים 10 microliters של תרבות להפסיק על מנות פטרי שהוכנו בעבר המכיל SDA, בתוספת כלוראמפניקול. חודרים את מנות פטרי באופן אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
עבור טרום inoculum להשתמש סיכה מעורקת כדי לבחור 10 מושבות של קנדידה אלביקנים מן הכלים פטרי למקם אותם לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 10 מיליליטר של מדיום YNB, בתוספת גלוקוז. דגירה הצינור באופן אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר מכן, להכין את inoculums על ידי הוספת תרבות זו המתנע לתוך מדיום YNB טרי, בתוספת גלוקוז, בפרופורציה אחת עד 10 לדילול.
השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את OD הראשונית ב 540 ננומטר. דגירה inoculums אירובי ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות, ולמדוד את OD הסופי ב 540 ננומטר. הפחת את ה- OD הסופי מ- OD הראשוני כדי לבדוק אם ה- OD של האנוקולומים נמצא בשלב הצמיחה באמצע יומן הרישום.
כדי להשיג inoculum עם 10 עד שבעה תאים למיליליטר, צנטריפוגה inoculum במשך חמש דקות ב 5, 500 פעמים G.Pour את העל טבעי לתוך מקור המכיל hypochlorite נתרן ולהוסיף YNB טרי לרכז את inoculum למחצית הנפח הקודם. מוסיפים מיליליטר אחד של inoculum לכל באר של צלחת פוליסטירן 24 היטב. דגירה אירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות כדי לאפשר הידבקות התא לתחתית הבאר.
לטפל בביופילמים במשך דקה אחת עם מיליליטר אחד של 0.12% כלורקסידין עבור ביופילמים שליטה חיובית. לשליטה שלילית, לטפל biofilms במשך דקה אחת עם מיליליטר אחד של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי. לאחר מכן, לשטוף את הבאר פעמיים, דקה אחת כל אחד, עם מיליליטר אחד של סטרילי 0.89% נתרן כלורי כדי להסיר תאים שאינם חסידים.
לאחר מכן הפעל נורה אדומה לא עקבית ולהשתמש במד כוח כדי למדוד את צפיפות הכוח של האור. לקבוע את זמן החשיפה בהתבסס על דרישת צפיפות האנרגיה של 87.6 joules לס"מ מרובע. מניחים את הצלחת מתחת לאור האדום.
שמור על המרחק בין מקור האור לביופילם לחמישה מיליליטר כדי להימנע מחימום הדגימה. לאחר החשיפה במשך דקה אחת, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום RPMI מעוקר לכל באר, ו דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. בבוקר, לחזור על אותו כביסה, טיפול קל, טיפולי בקרה חיוביים ושליליים, ודגירה במשך שש שעות עם מדיום RPMI.
שוב, לשטוף את הביופילמים פעמיים, לחשוף אותם לאור אדום, ולבצע טיפולי בקרה חיוביים ושליליים. שאפו את הפתרון בארות והוסיפו מדיום RPMI. חזור על הדגירה, הכביסה, הטיפול הקל וטיפולי הבקרה החיוביים והשליליים, עד להשגת 48 שעות של התפתחות ביופילם.
כדי להתחיל לעבד, השלך את המדיום והוסף מיליליטר אחד של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי ל באר, ולהשתמש בקצה פיפטה כדי לגרד את הביופילם מה באר. מעבירים את הביופילם שהוסר לצינור סטרילי. מוסיפים עוד מיליליטר של סטרילי, 0.89% נתרן כלורי ל באר.
לגרד אותו שוב ולהוסיף את ההשעיה לאותו צינור, עבור נפח כולל של 2 מיליליטר. מערבולת נמרצת ההשעיה ביופילם לדקה אחת. לניתוח CFU, להעביר aliquot של 0.1 מיליליטר מן ההשעיה biofilm לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 900 microliters של 0.89% פתרון נתרן כלורי עבור כל דילול.
מדללים את תמיסת הביופילם מ-10 לתמיסה השלילית, ל-10 לארבע השליליות, בתמיסת מלח. זרעים 50 microliters של כל דילול צלחות SDA, ו דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. ספור את המושבות והחל את הנוסחה.
לניתוח משקל יבש, ראשית לשקול ולתייג צינורות מיקרו צנטריפוגה. מוסיפים 0.1 מיליליטר של ההשעיה ביופילם ומיליליטר אחד של אתנול מוחלט לתוך הצינורות, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה זה 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות.
השליכו את העל-טבעי והמקמים את הצינורות במייבש כדי לייבש את הדגימות למשך שבוע. לשקול את צינורות מיקרו צנטריפוגה שוב, ולעשות את ההפחתה כדי להשיג את משקל ביומסה. בניסוי זה, לאחר טיפולי פר-דיאם באור אדום למשך דקה לביופילמים של קנדידה אלביקנים, הופחת ה-CFU, בהשוואה לשליטה השלילית שטופלה בנתרן כלורי.
התוצאות של ביומסה של ביופילמים קנדידה אלביקנים לאחר טיפולים יומיים, להראות את הקבוצה שטופלו באור אדום הציג הפחתה דומה של ביומסה לזה שנצפה בקבוצת הביקורת החיובית, מטופלים עם כלורהקסידין. שתי הקבוצות גם הראו דמיון סטטיסטי זו עם זו. בעוד ששניהם הראו הפחתה של הביומסה, בהשוואה לשליטה השלילית שטופלה בנתרן כלורי.
כמויות נחותות של קנדידה אלביקנים מסיסים ובלתי מסיסים EPS, נצפתה בשליטה חיובית, לעומת שליטה שלילית. למרות שלא מובהק סטטיסטית, יישום פר diem של אור אדום פחתה מספרית כמויות של EPS מסיסים EPS מסיסים EPS מסיסים. הבקרה השלילית והקבוצה שטופלה באור אדום הראו דמיון סטטיסטי.
מדידת צפיפות הכוח של האור, באמצעות מד כוח לפני תחילת הטיפול כדי לקבוע את תקופות היישום המדויקות. הצעדים מבטיחים כי צפיפות האנרגיה תמיד תהיה 87.6 joules אחוז סנטימטרים בריבוע. השתמש בנוסחה שצוטטה בעבר.
המדידה נעשתה באמצעות אותו דבר מהאור לבקבוק הצלחות, חמישה מילימטרים. קשר בין פוטותרפיה ותרופות נגד פטריות ניתן ללמוד כדי לבדוק אם הטיפול הקדם עם אור אדום, ואחריו יישום סמים, משפר חדירת סמים לתוך biofilm. לטיפול פעמיים ביום התאמתי את פרוטוקולי המעבדה שלנו, המספקים מודל ביופילם קל ובלתי ניתן לשחזור, המספק תשובות לגבי כדאיות, משקל יבש כמויות פוליסכריד חוץ-תאי לאחר טיפול באור אדום.
הפרוטוקול הוא כללי ונוה יכול לשמש לבדיקת טיפולים אחרים, בנוסף לאור אדום, כולל תרופות, אורות אחרים, או שילוב של אור ותרופות. עבודה עם מיקרואורגניזמים דורשת ציוד מיוחד, כגון משקפי בטיחות, חלוק מעבדה לכפתורים וכפפות ניטרו.
