孟加拉玫瑰介导的光动力疗法抑制 白色念珠菌

这项研究是一个简单，通用且易于的系统，用于检查对各种微生物和细胞的不同光动力学效应。在这个系统中，LED可以根据实验设计适应不同的排列。在一次实验中，可以在96孔板甚至384孔板中计算PDT的不同条件。

这种技术可用于治疗真菌性角膜炎，因为全球约有150， 000人尽管进行了强化治疗，但仍会失去眼睛。首先，从LED灯带上切割四个绿色LED，并将它们与96孔板的三个孔对齐。使用光功率计测量540纳米处的LED通量率。

在照射过程中，使用与板一起组装的电风扇将恒温保持在25摄氏度。使用无菌环，从琼脂平板中挑选一个白色念珠菌菌落，并将其添加到含有三毫升YPD培养基的无菌玻璃管中。将试管以155 RPM的转速在25摄氏度下孵育14至16小时以培养酵母培养物。

接下来用YPD培养基将过夜培养物稀释至OD 600值为0.5。在30摄氏度下孵育，以155 RPM旋转4小时，以达到对数生长阶段。用新鲜的YPD培养基重复对数期培养物的稀释至OD 600值为0.65，以获得每毫升约10至第七个菌落形成单位的一倍。

同时在1X PBS中制备4%的孟加拉玫瑰储备溶液。使用0.22微米过滤器进行过滤器灭菌。向1毫升对数相培养物中加入111微升的2%玫瑰孟加拉溶液，并在室温下的不同时间点共培养，以了解细胞中RB的吸收。

在室温下以16，100倍G离心2 1/2分钟，并用一毫升1X PBS洗涤共培养物三次。洗涤后，将白色念珠菌培养物重悬于一毫升1X PBS中。对于每种情况，将培养物分配到96孔板中的三个不同孔中。

将孔与 LED 阵列对齐。在灯光暴露的组中，打开电风扇和灯。照射后，通过从一个孔中取出20微升共培养溶液并将其加入含有180微升1X PBS的管中来进行十倍连续稀释两次。

然后在YPD琼脂平板的一象限中滴下20微升每个连续稀释液，以获得平板上的可数菌落。荧光显微镜显示白色念珠菌在红色荧光下与孟加拉玫瑰立即染色。孵育15分钟后，大多数细胞被玫瑰染色，表明它以时间依赖性方式进入细胞。

此外，用光活化玫瑰孟加拉在细胞中产生自由基和单线态氧，导致细胞死亡。在没有玫瑰孟加拉或辐照的情况下，没有观察到细胞死亡。白色念珠菌在绿光照射后以轻剂量依赖性方式在0.2%孟加拉玫瑰的存在下受到抑制。

重要的是，首先96孔板必须与LED的中心对齐。其次，所使用的琼脂平板必须彻底干燥，以防止单独菌落的混合。在平板上生长的白色念珠菌可以进一步送去进行基因分析，这可以回答PDT如何影响细胞的基因表达。

这些技术为检查PDT如何在不同细胞类型（癌细胞，细菌，真菌或病毒）上工作铺平了道路，具有简单，廉价和多功能的平台。