我们概述了检测和量化驼鹿血清中的碘氧酸的程序。结果表明，碘氧酸可用作生物标记物，以验证该物种的β吸收。这种方法的主要优点是，它允许使用简单的蛋白质沉淀技术，将碘氧酸类比在十亿级部分进行定量。
对于移动阶段 A，将一毫升甲酸与一升超纯水混合。对于移动阶段 B，将一毫升甲酸与一升乙酰三叶酸混合。对于稀释剂，将一毫升三氟乙酸与200毫升乙酰酸合并。
接下来，在微平衡上重约10毫克甲基-IPA，并记录质量为正负0001毫克。定量地将甲基-IPA转移到10毫升A类体积烧瓶中，使用4至5毫升的乙酰三酯。声波一分钟溶解所有固体，然后用醋酸酯体积。
将每股约8毫升的琥珀色玻璃瓶与PTFE衬里瓶，并在室温下储存样品。然后，将剩余库存转移到危险废物中。对于25X库存7甲基IPA库存准备的甲基IPA和乙酰三叶酸库存，每毫升约200微克。
将一毫升的库存转移到五毫升的烧瓶中，然后用乙酰三叶酸稀释成体积。然后，将库存转移到一个八毫升琥珀色玻璃瓶与PTFE衬里盖和储存在室温下。使用重复移液器，在文本协议中描述的六个附加的 25X 甲基 IPA 库存中，用 PTFE 衬里盖准备 8 毫升琥珀玻璃小瓶，并在室温下储存。
对于 25X 代理库存，使用 100 微升玻璃注射器将 0.1 毫升浓缩乙基-IPA 库存转移到 10 毫升 A 级卷瓶中，然后用乙酰三酯稀释至体积。将代理库存的大约 8 毫升转移到带 PTFE 衬里盖的 8 毫升琥珀色玻璃瓶中，并在室温下储存。将剩余库存转移到危险废物中。
接下来，在10毫升螺丝顶玻璃自动取样器小瓶中制备含有甲基-IPA和乙基-IPA的4X库存，如文本协议中所述。例如，要准备库存 4X7，使用具有 0.5 毫升容量尖端的重复移液器将 25X 库存 7 甲基 IPA 库存的 0.2 毫升添加到两毫升小瓶中。使用具有 0.5 毫升容量尖端的重复移液器，加入 25X 代理乙基 IPA 库存的 0.2 毫升。
使用具有 1 毫升容量尖端的重复移液器添加 0.85 毫升的乙酰三叶酸。安全盖住小瓶，倒置五次，以混合。之后，按照文本协议中所述，在两毫升螺丝顶自动采样器小瓶中准备标准曲线。
例如，要准备标准七，将 4X7 库存的 0.2 毫升添加到两毫升小瓶中，使用具有 0.5 毫升容量尖端的重复移液器。使用具有 1 毫升容量尖端的重复移液器加入 0.6 毫升的超纯度电离水。安全盖住小瓶，倒置五次以混合。
对于每个样品，准备一个1.5毫升的微型离心管，内含200至300毫克氯化钠，并安排在80位置的塑料架上。对于每个样品，将一个 1.5 毫升微型离心管标记为 A，将第二个微型离心管标记为 B。将血清提取所需的以下材料和设备放在二类生物安全柜中:微型离心管、 涡流混合器、具有 0.5 毫升和 5 毫升容量的重复移液器、带 1000 微升尖端的 100 至 1000 微升空气位移液器、每个具有约 100 毫升稀释剂和超纯度电离水的容器以及生物危害废物容器。
接下来，从冷冻储存中去除血清样本，并在生物安全柜中加热至室温。漩涡在取样前混合每个血清样本。使用具有 0.5 毫升容量尖端的重复移液器，将 05 毫升的驼鹿血清分配到管 A 中，并加入 25 倍代理库存的 05 毫升。
然后使用具有 5 毫升容量尖端的重复移液器向管 A 添加 0.95 毫升稀释剂。牢固地盖住管子，将涡流混合10至15秒。接下来，将控制驼鹿血清添加到管A.使用具有0.5毫升容量尖端的重复移液器，用我-IPA强化每个4QC样品。
将 25 倍代理库存添加到 QC 样本中。然后，将稀释剂添加到 QC 样本中。盖住管子和涡流混合。
将预称氯化钠分配到管 A 中，在 8 到 12 秒内将涡流混合三次。然后，使用 70%异丙醇擦拭装有管 A 的小瓶架外表面。从生物安全柜中去除样品后，在1200次G下离心管S1分钟分离水位和乙酰三叶酸相。
移液器 0.8 毫升的上乙酰三角到管 B，使用 100 至 1000 微升空气位移液器。将管 A 中剩余的溶液转移到危险废物中，将空管丢弃在生物危害废物容器中。现在，在45摄氏度的水浴中，用温和的氮气从B管中去除乙酮和三氟乙酸酯。
使用重复的移液器和涡流混合，将0.25毫升乙酰酸杆菌加入B管，进行4至5秒钟的涡流混合。然后，在1200倍G下离心2至4秒，收集管底的液体。离心后，使用具有5毫升容量的重复移液器将0.75毫升的超纯去离子水加入B管，并加入4至5秒的涡流混合。
在 1200 倍 G 下离心一分钟，以澄清样品。然后，使用1000微升空气位移液器将0.75毫升的上流液转移到自动取样器小瓶中，并丢弃生物危害废物容器中的移液器尖端。安全盖住每个自动取样器小瓶，进行LC-MS/MS分析。
将B管中剩余的溶液转移到危险废物中，将空管丢弃在生物危害废物容器中。使用文本协议中描述的所有参数配置 LC-MS/MS。打开 LC-MS/MS 电源，使柱达到 70 摄氏度，然后将流量设置为每分钟 0.8 毫升。
在数据采集软件中设置一个序列，在每批由质量控制样品和未知样品组成的批次之前和之后注入标准曲线。使用文本协议中列出的参数注入所有标准和样本并获取 MR 离子色谱图。序列完成后，关闭 LC-MS/MS 并处置危险废物中的所有自动取样器小瓶。
对照驼鹿血清的离子色谱说明了乙基-IPA的保留时间以及甲基-IPA在指示的保留时间没有。质量控制样品的离子色谱图说明了甲基-IPA与乙基-IPA的基线分离，以及甲基-IPA的限定符和限定符过渡。研究中代表性样品的离子色谱图显示，观察到的血清浓度为每微升甲基 IPA 33.5 微克。
此处显示了用甲基 IPA 强化的控制驼鹿血清的准确性和精度结果。回收百分比从96.9%到109%不等，三个防御工事水平的相对偏差率分别是3.4%和2.3%。此处显示了使用乙基-IPA 强化的控制驼鹿血清的精度和精度结果。
回收率从89.5%到115%不等，五个防御工事水平的相对标准偏差率分别是4.3%1.5%2.3%5.6%和1.1%。所有提供乙基-IPA和甲基-IPA诱饵的驼鹿在24小时时间限制内消耗了至少25%的诱饵，并分别在其血清中含有乙基-IPA和甲基-IPA的可量化水平。通过配置LC-MS来收集其他异丙酸类比的数据，如丙烯和丁基氧氧酸，可以增加该方法的潜在效用。
我们鼓励人员咨询免疫做法咨询委员会或机构生物安全委员会的最新建议，以指导是否需要接种接触前狂犬病疫苗。本协议涉及未稀释血清的第 2.3 至 2.6 节应在第二类生物安全柜中执行。
