Firavun serumundaki iofenoksik asidi tespit etmek ve ölçmek için bir prosedür belirledik. Sonuçlar, iofenoksik asit in türlerde beta alımını doğrulamak için biyolojik bir belirteç olarak kullanılabilir öneririz. Bu yöntemin en büyük avantajı, protein çökeltme tekniğini basit bir şekilde kullanarak, milyar seviyelerinde iofenoksik asit analoglarının ölçülmesine olanak sağlamasıdır.
Mobil faz A için, bir mililitre formik asidi bir litre ultra saf su yla birleştirin. Mobil faz B için, bir mililitre formik asidi bir litre asetonitril ile birleştirin. Dilüent için, bir mililitre trifloroasetik asidi 200 mililitre asetonitril ile birleştirin.
Daha sonra, mikro denge üzerinde yaklaşık 10 miligram metil-IPA tartın ve kütleyi artı veya eksi 0001 miligrama kaydedin. Metil-IPA'yı 4-5 mililitre asetonitril kullanarak 10 mililitrelik a volumetrik bir şişeye nakledin. Sonicate bir dakika için tüm katı çözünür ve daha sonra asetonitril ile hacim getirmek.
Ptfe kaplı kapaklı sekiz mililitrelik kehribar cam şişelere her stoğun yaklaşık sekiz mililitresini aktarın ve numuneleri oda sıcaklığında saklayın. Daha sonra, kalan stoktehlikeli atık aktarın. 25X stok için yedi metil-IPA stok mililitre başına yaklaşık 200 mikrogram metil-IPA ve asetonitril bir stok hazırlamak.
Bir mililitre stoğu nisbi bir şişeye aktarın ve asetonitril ile hacime seyreltin. Daha sonra, ptfe kaplı kapak ve oda sıcaklığında saklamak ile sekiz mililitrelik kehribar cam şişe stok aktarın. Tekrar pipettor kullanarak, ptfe kaplı kapaklar ve oda sıcaklığında saklamak ile sekiz mililitrelik kehribar cam şişeler metin protokolünde açıklanan altı ek 25X metil-IPA stokları hazırlamak.
25X vekil stok için, 100 mikrolitre cam şırınga kullanarak 10 mililitre sınıf bir hacimsel şişe konsantre etil-IPA stok 0.1 mililitre aktarın ve daha sonra asetonitril ile hacim seyreltmek. Ptfe kaplı kapak lı sekiz mililitrelik kehribar cam şişeye yaklaşık sekiz mililitre vekil stok aktarın ve oda sıcaklığında saklayın. Kalan stoku tehlikeli atıklara aktarın.
Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, 10 mililitrelik vidalı cam oto örnekleyici şişelerinde hem metil-IPA hem de etil-IPA içeren 4X stoklar hazırlayın. Örneğin, stok 4X7 hazırlamak için, 0,5 mililitre kapasiteli ucu ile tekrar pipettor kullanarak iki mililitrelik şişe iki mililitre lik şişe 25X stok yedi metil-IPA stok 0,2 mililitre ekleyin. 0,5 mililitre kapasiteli ucu ile tekrar pipettor kullanarak 25X vekil etil-IPA stok 0,2 mililitre ekleyin.
Bir mililitre kapasiteli ucu ile tekrar pipettor kullanarak asetonitril 0,85 mililitre ekleyin. Şişeyi güvenli bir şekilde kaplayın ve karıştırmak için beş kez ters çevirin. Bunu takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi iki mililitre vidaüstü otomatik örnekleyici şişeleri standart eğriyi hazırlayın.
Örneğin, standart yedi hazırlamak için, 0,5 mililitre kapasiteli ucu ile tekrar pipettor kullanarak, iki mililitrelik bir şişe için 4X7 stok0,2 mililitre ekleyin. Bir mililitre kapasiteli ucu olan tekrar pipettor kullanarak 0,6 mililitre ultra saflıktaki iyonize su ekleyin. Şişeleri güvenli bir şekilde kaplayın ve karıştırmak için beş kez ters çevirin.
Her numune için, 200 ila 300 miligram sodyum klorür içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüp hazırlayın ve tüpleri 80 pozisyonda plastik rafta düzenleyin. Her örnek için, bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüp a ve ikinci bir mikro santrifüj tüp olarak etiket B.80 pozisyon plastik raf tüpleri düzenleyin. Bir sınıf iki biyogüvenlik kabine serum ekstraksiyon için gerekli aşağıdaki malzeme ve ekipman yerleştirin: mikro santrifüj tüpler, bir girdap karıştırıcı, 0.5 mililitre ve beş mililitre kapasiteli ipuçları ile tekrar pipet, 1000 mikrolitre ipuçları ile 100 ila 1000 mikrolitre hava deplasman pipet, yaklaşık 100 mililitre her diluent ve ultra saflıkİyonlu su geçirmez, biyolojik atık ve biyolojik atık.
Daha sonra, dondurulmuş depolama ve biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığına sıcak serum örnekleri çıkarın. Vortex örneklemeden önce her serum örneğini karıştırın. 0,5 mililitre kapasiteli bir pipettor kullanarak, tüp A içine 05 mililitre firavun faresi serumu dağıtın ve 25X vekil stok 05 mililitre ekleyin.
Daha sonra 5 mililitre kapasiteli bir ucu olan tekrar pipettor kullanarak A tüpüne 0,95 mililitre dilüent ekleyin. Tüpleri güvenli bir şekilde kaplayın ve girdap 10 ila 15 saniye karıştırın. Daha sonra, kontrol mongoose serumtüp A.Fortify me-IPA ile 0.5 mililitre kapasiteli ucu ile tekrar pipettor kullanarak 4QC örneklerinin her ekleyin.
QC örneklerine 25X vekil stok ekleyin. Daha sonra, QC örneklerine dilüent ekleyin. Tüpleri ve girdap karışımını kaplayın.
Önceden tartılmış sodyum klorürtüp A ve girdap karışımı içine sekiz ila 12 saniye için üç kez dağıtın. Daha sonra, %70 isopropanol kullanarak A tüpü içeren şişe rafının dış yüzeylerini silin. Biyogüvenlik kabininden numuneleri çıkardıktan sonra, santrifüj tüpü A 1200 kez G'de bir dakika sulu ve asetonitil fazları ayırmak için.
Pipet 0.8 mililitre üst asetonitril fazı ile B tüpüne, 100 ila 1000 mikrolitrelik hava deplasman pipeti kullanır. A tüpündeki kalan çözeltiyi tehlikeli atıklara aktarın ve boş tüpü biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atın. Şimdi, 45 santigrat derece su banyosunda hafif bir azot gazı akışıyla Asetonitril ve trifloroasetik tüpünden çıkar.
Dört ila beş saniye boyunca tekrar pipettor ve girdap karışımı kullanarak b tüpüne 0,25 mililitre asetonitril ekleyin. Daha sonra, 1200 kez G'de 2-4 saniye boyunca tüpün altındaki sıvıyı toplamak için santrifüj. Santrifüjden sonra, b tüpüne 5 mililitre kapasiteli bir pipet torcu kullanarak 4-5 saniye boyunca 0,75 mililitre ultra saf deiyonize su ekleyin.
Numuneyi netleştirmek için 1200 kez G'de bir dakika lığına santrifüj. Daha sonra, 1000 mikrolitrelik hava deplasman pipetini kullanarak 0,75 mililitre süpernatantı otomatik numune leyici şişeye aktarın ve pipet uçlarını biyolojik tehlike atık kabına atın. LC-MS/MS analizi için her otomatik numune şişeyi güvenli bir şekilde kapla.
B tüpünde kalan çözeltiyi tehlikeli atıklara aktarın ve boş tüpü biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atın. LC-MS/MS'i metin protokolünde açıklanan tüm parametrelerle yapılandırın. LC-MS/MS'nin gücü ve akış hızını dakikada 0,8 mililitreye ayarlamadan önce sütunun 70 santigrat dereceye ulaşmasını bekleyin.
Kalite kontrol örnekleri ve bilinmeyen örneklerden oluşan her partiden önce ve sonra standart eğriyi enjekte etmek için veri toplama yazılımında bir sıra ayarlayın. Tüm standartları ve numuneleri enjekte edin ve metin protokolünde listelenen parametreleri kullanarak MR iyon kromatogramları edinin. Dizi tamamlandıktan sonra, LC-MS/MS'i kapatın ve tüm otomatik numune şişelerini tehlikeli atıklara atın.
Kontrol mongoose serumunun iyon kromatogramı, etil-IPA'nın bekletme süresini ve belirtilen tutma süresinde metil-IPA'nın eksikliğini göstermektedir. Kalite kontrol numunesinin iyon kromatogramı, metil-IPA'nın etil-IPA'dan temel ayrıştırMasını ve metil-IPA için niceleyici ve niteleyici geçişlerini göstermektedir. Çalışmadan alınan temsili numunenin iyon kromatogramı, metil-IPA mikrolitresi başına 33,5 mikrogram serum konsantrasyonu gösterdi.
Metil-IPA ile güçlendirilmiş kontrol mongoose serumu için doğruluk ve kesin sonuçlar burada gösterilmiştir. Yüzde geri kazanımlar %96,9 ile %109 arasında değişmekteydi Üç istihkak seviyesindeki yüzde göreceli sapma sırasıyla %3,4%1,7 ve %2,3 idi. Etil-IPA ile güçlendirilmiş kontrol mongoose serumiçin doğruluk ve hassas sonuçlar burada gösterilmiştir.
Yüzde geri kazanımlar %89,5 ile %115 arasında değişmekteydi Beş istihkak seviyesindeki yüzde bağıl standart sapma sırasıyla %4,3 %1,5%2,3%5,6 ve %1,1 idi. Tüm mongooses etil-IPA ve metil-IPA yem 24 saat kısıtlama içinde yem en az% 25 tüketilen sunulan ve etil-IPA ve metil-IPA ölçülebilir düzeyleri vardı, onların sera, sırasıyla. Yöntemin potansiyel yararı, LC-MS'nin propil ve bütil iofenoksik asit gibi diğer iofenoksik asit analogları için veri toplamak üzere yapılandırılarak artırılabilir.
Personeli, aşı lama uygulamaları danışma komitesinin veya ön maruziyet aşısının gerekli olup olmadığı konusunda rehberlik için kurumsal biyogüvenlik komitesinin en son tavsiyelerine danışmaya teşvik ettik. Seyreltilmemiş serum la çalışmayı içeren bu protokolün 2.3 ile 2.6.
