マングース血清中のイオフェノキ酸を検出し定量する手順を概説した。結果は、イオフェノキシン酸が種のベータ摂取量を確認するための生物学的マーカーとして使用され得ることを示唆している。この方法の主な利点は、タンパク質沈殿技術を簡単に行うため、10億レベルあたりの部分でイオフェノキシン酸アナログの定量を可能にすることです。
移動相Aの場合は、1ミリリットルのギ酸と1リットルの超純水を組み合わせます。移動相Bの場合は、1ミリリットルのギ酸と1リットルのアセトニトリルを組み合わせます。希釈剤の場合は、トリフルオロ酢酸1ミリリットルとアセトニトリル200ミリリットルを組み合わせます。
次に、マイクロバランスでメチル-IPAの約10ミリグラムの重量を量り、プラスマイナス0001ミリグラムに質量を記録します。メチル-IPAを10ミリリットル級A体積フラスコに定量的に移し、4〜5ミリリットルのアセトニトリルを使用する。すべての固体を溶解し、アセトニトリルでボリュームに持って来るために1分間ソニッケート。
各ストックの約8ミリリットルをPTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルに移し、サンプルを室温で保管します。次に、残りの在庫を有害廃棄物に移します。25Xストックの7つのメチル-IPAストックは、1ミリリットル当たり約200マイクログラムでメチルIPAとアセトニトリルの在庫を準備します。
ストックの1ミリリットルを5ミリリットルのフラスコに移し、アセトニトリルで分ける。その後、PTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルにストックを移し、室温で保管します。繰り返しピペットを使用して、テキストプロトコルに記載されている6つの追加の25XメチルIPAストックを、PTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色ガラスバイアルで準備し、室温で保管します。
25X代理ストックの場合、濃縮エチルIPAストックの0.1ミリリットルを10ミリリットル級Aボリュームフラスコに100マイクロリットルガラスシリンジを使用して移し、アセトニトリルで体積に希釈します。代理ストックの約8ミリリットルをPTFE裏地付きキャップ付きの8ミリリットルの琥珀色のガラスバイアルに移し、室温で保管します。残りの在庫を有害廃棄物に転送します。
次に、テキストプロトコルに記載されているように、メチル-IPAとエチルIPAの両方を含む4X株を10ミリリットルスクリュートップガラスオートサンプラーバイアルで調製する。例えば、ストック4X7を準備するには、0.5ミリリットル容量のチップを有する繰り返しピペットを使用して、25Xストック7個のメチルIPAストックを2ミリリットルバイアルに0.2ミリリットル添加します。0.5ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用して25X代理エチル-IPAストックの0.2ミリリットルを追加します。
1ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用してアセトニトリルの0.85ミリリットルを追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5回反転して混ぜます。これに続いて、テキストプロトコルに記載されているように、2ミリリットルスクリュートップオートサンプラーバイアルで標準曲線を準備します。
例えば、標準の7を準備するには、0.5ミリリットル容量のチップを持つ繰り返しピペットを使用して、2ミリリットルバイアルに4X7ストックの0.2ミリリットルを追加します。1ミリリットルの容量の先端と反復ピペットを使用して、超純度イオン化水の0.6ミリリットルを追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5回反転して混ぜます。
各サンプルに対して、200~300ミリグラムの塩化ナトリウムを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管を準備し、80位置のプラスチックラックにチューブを配置します。各サンプルに対して、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをAとラベル付けし、2番目のマイクロ遠心分離管をB.80位置のプラスチックラックにチューブを配置します。クラス2のバイオセーフティキャビネットに血清抽出に必要な材料と機器を次に配置します:マイクロ遠心分離管、ボルテックスミキサー、0.5ミリリットルと5ミリリットル容量チップを備えた繰り返しピペット、1000マイクロリットル先端を備えた100〜1000マイクロリットルの空気変位ピペット、約100ミリリットルの希釈剤と超純度の容器を含む容器、
次に、凍結した貯蔵から血清サンプルを取り除き、バイオセーフティキャビネット内の室温まで温めます。渦はサンプリング前に各血清サンプルを混合する。0.5ミリリットルの容量の先端の反復ピペットを使用して、05ミリリットルのマングース血清をチューブAに分配し、25Xサロゲートストックの05ミリリットルを加える。
その後、5ミリリットルの容量の先端を持つ繰り返しピペットを使用してチューブAに希釈剤の0.95ミリリットルを加えます。チューブをしっかりとキャップし、渦ミックスを10~15秒間キャップします。次に、コントロールマングース血清をチューブAに加え、0.5ミリリットルの容量チップを備えた繰り返しピペットを使用してme-IPAで4QCサンプルをそれぞれFortifyします。
QC サンプルに 25X サロゲート ストックを追加します。次に、QC サンプルに希釈剤を加えます。チューブと渦ミックスをキャップします。
計量済みの塩化ナトリウムをチューブAに分配し、渦ミックスを3回8~12秒間混合します。次に、70%イソプロパノールを使用して、チューブAを含むバイアルラックの外側の表面を拭き取ります。バイオセーフティキャビネットからサンプルを取り出した後、遠心管Aを1200倍Gで1分間、水相とアセトニトリル相を分離した。
上部アセトニトリル相のピペット0.8ミリリットルをチューブBに、100〜1000マイクロリットルの空気変位ピペットを用いた。残りの溶液をチューブA内で有害廃棄物に移し、空のチューブを生物危険廃棄物容器に捨てます。さて、45°Cの水浴で窒素ガスの穏やかな流れでチューブBからアセトニトリルとトリフルオロ酢を取り除きます。
繰り返しピペットと渦ミックスを4〜5秒間使用して、チューブBにアセトニトリルの0.25ミリリットルを加えます。次いで、1200倍Gで1200倍のGで遠心分離機を2〜4秒間、チューブの底に液体を集めた。遠心分離後、5ミリリットルの容量チップと渦ミックスを5〜5秒間繰り返しピペットを使用して、チューブBに0.75ミリリットルの超純脱イオン水を加えます。
遠心分離機を1200倍Gで1分間、試料を明らかにする。次に、1000マイクロリットルの空気変位ピペットを使用して、上清の0.75ミリリットルをオートサンプラーバイアルに移し、バイオハザード廃棄物容器内のピペットチップを廃棄します。LC-MS/MS分析のために、各自動サンプラーバイアルを安全にキャップします。
残りの溶液をチューブB内で有害廃棄物に移し、空のチューブを生物危険廃棄物容器に捨てます。テキスト プロトコルで説明されているすべてのパラメータを使用して、LC-MS/MS を設定します。LC-MS/MSの電源を入れ、列を70°Cに達してから、流量を毎分0.8ミリリットルに設定します。
データ収集ソフトウェアでシーケンスを設定し、品質管理サンプルと未知のサンプルからなる各バッチの前後に標準曲線を挿入します。すべての標準とサンプルを注入し、テキストプロトコルに記載されているパラメータを使用してMRイオンクロマトグラムを取得します。シーケンスが完了したら、LC-MS/MSをオフにし、すべてのオートサンプラーバイアルを有害廃棄物に廃棄します。
対照マングース血清のイオンクロマトグラムは、エチルIPAの保持時間および示された保持時間におけるメチルIPAの欠如を示す。品質管理サンプルのイオンクロマトグラムは、メチル-IPAとエチル-IPAのベースライン分離、ならびにメチルIPAの量化および修飾子遷移を示しています。本研究の代表的サンプルのイオンクロマトグラムは、メチル-IPAのマイクロリットル当たり33.5マイクログラムの観察された血清濃度を示す。
メチル-IPAで強化されたマングース血清の精度と精度を示します。回収率は96.9%から109%の範囲で、3つの要塞レベルでの相対偏差の割合はそれぞれ3.4%1.7%と2.3%であった。エチル-IPAで強化されたマングース血清の精度と精度の結果をここに示します。
回収率は89.5~115%の範囲で、5つの要塞レベルでの相対標準偏差の割合はそれぞれ4.3%1.5%2.3%5.6%と1.1%であった。すべてのマングースは、エチルIPAとメチルIPA餌を提供し、24時間の時間制約内で餌の少なくとも25%を消費し、それぞれセラにエチルIPAとメチルIPAの定量可能なレベルを有していた。この方法の潜在的な有用性は、プロピルおよびブチルイオフェノキシン酸などの他のイオフェノキシン酸類似体のデータを収集するようにLC-MSを構成することによって増加することができる。
我々は、予防接種の実施に関する諮問委員会の最新の勧告、または彼らの機関バイオセーフティ委員会に相談して、暴露前狂犬病ワクチン接種が必要かどうかのガイダンスを求めることを奨励した。このプロトコルのセクション 2.3 から 2.6 は、希釈されていない血清を使用して作業を行うクラス 2 のバイオセーフティ キャビネットで実行する必要があります。
