Мы наметили процедуру обнаружения и количественной оценки иофеноксической кислоты в мангузной сыворотке. Результаты показывают, что иофеноксовая кислота может быть использована в качестве биологического маркера для проверки бета поглощения в виде. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет количественно проводить аналоги иофеноксической кислоты на участках на миллиард уровней, используя простую для выполнения технику выпадения белков.
Для мобильной фазы А смешайте один миллилитр кремовой кислоты с одним литром ультра чистой воды. Для мобильной фазы В смешайте один миллилитр кремовой кислоты с одним литром ацетонитрила. Для разбомбительного, объединить один миллилитр трифтороацетической кислоты с 200 миллилитров ацетонитрила.
Затем взвесим около 10 миллиграммов метил-МПА на микробалансе и запиши массу до плюс-минус 0001 миллиграмм. Количественно перенести метил-IPA в 10 миллилитров класса А томтрической колбы, используя от четырех до пяти миллилитров ацетонитрила. Sonicate в течение одной минуты, чтобы растворить все твердые тела, а затем довести до объема с ацетонитрилом.
Перенесите примерно восемь миллилитров каждого запаса на восемь миллилитров янтарных стеклянных флаконов с крышками, облицованными PTFE, и храните образцы при комнатной температуре. Затем перенесите оставшийся запас на опасные отходы. Для запаса 25X семь запасов метил-IPA подготовить запас метил-IPA и ацетонитрил примерно на 200 микрограмм на миллилитр.
Перенесите один миллилитр бульона в пятими миллилитровую колбу и разбавьте до объема ацетонитрилом. Затем перенесите бульон на восьмими миллилитровый флакон из янтарного стекла с крышкой, облицованной PTFE, и храните при комнатной температуре. Используя повторный пипеток, подготовьте шесть дополнительных запасов метил-IPA 25X, описанных в текстовом протоколе, в восьми миллилитровых стеклянных флаконах из янтаря с крышками, облицованными PTFE, и храните при комнатной температуре.
Для 25X суррогатного фонда, передача 0,1 миллилитров концентрированного этил-IPA акций в 10 миллилитров класса объемной колбы с использованием 100 микролитров стеклянный шприц, а затем разбавить до объема с ацетонитрилом. Перенесите около восьми миллилитров суррогатного бульона на восьмими миллилитровый флакон из янтарного стекла с крышкой, облицованной PTFE, и храните при комнатной температуре. Перенесите оставшийся запас на опасные отходы.
Далее, подготовить 4X запасов, содержащих как метил-IPA и этил-IPA в 10 миллилитров винт-топ стекла авто сэмплер флаконы, как описано в текстовом протоколе. Например, чтобы подготовить запас 4X7, добавьте 0,2 миллилитров запаса 25X семь метил-IPA запасов в два миллилитров флакона с использованием повторного пипетки с 0,5 миллилитров мощности отзыв. Добавьте 0,2 миллилитров бульона 25X суррогатного этил-IPA с помощью повторного пипетора с наконечником емкостью 0,5 миллилитров.
Добавьте 0,85 миллилитров ацетонитрила с помощью повторного пипетки с одним миллилитровым наконечником емкости. Cap флакон надежно и инвертировать пять раз, чтобы смешать. После этого подготовь стандартную кривую в двух миллилитровых автоматических сэмплерных флаконах, описанных в текстовом протоколе.
Например, чтобы подготовить стандартную семерку, добавьте 0,2 миллилитров запаса 4X7 в двухми миллилитровый флакон, используя повторный трубоотвод с наконечником емкостью 0,5 миллилитров. Добавьте 0,6 миллилитров ионизированной воды сверх чистоты с помощью повторного трубоуправляемого с наконечником емкостью в миллилитр. Cap флаконы надежно и инвертировать пять раз, чтобы смешать.
Для каждого образца, подготовить 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки, содержащей от 200 до 300 миллиграммов хлорида натрия и организовать трубки в 80 позиции пластиковой стойки. Для каждого образца, этикетка 1,5 миллилитров микро центрифуги трубки, как А и второй микро центрифуги трубки, как B.Arrange труб в 80 позиции пластиковой стойки. Поместите следующие материалы и оборудование, необходимые для извлечения сыворотки, в шкаф биобезопасности второго класса: микро центрифуги, вихревой смеситель, повторяющийся пипетчик с 0,5 миллилитров и пятью миллилитровых наконечниками емкости, пипетка водоизмещением воздуха от 100 до 1000 микролитров, контейнеры с примерно 100 миллилитров каждый из дилентной и ультра чистоты ионизированной воды, а также контейнер для биоопасных отходов.
Затем удалите образцы сыворотки из замороженного хранилища и подогрете до комнатной температуры в кабинете биобезопасности. Vortex смешивает каждый образец сыворотки перед отбором проб. Используя повторный пипеток с наконечником емкостью 0,5 миллилитра, выложить 05 миллилитров мангустной сыворотки в трубку А и добавить 05 миллилитров 25X суррогатного бульона.
Затем добавьте 0,95 миллилитров разбомбительного в трубку А с помощью повторного пипетки с пятимиллилитровым наконечником емкости. Крышка трубки надежно и вихрь смеси в течение 10 до 15 секунд. Затем добавьте сыворотку для контроля мангуста в трубку A.Fortify каждый из образцов 4'C с me-IPA с помощью повторного пипетора с наконечником емкостью 0,5 миллилитров.
Добавьте 25X суррогатный запас в образцы КК. Затем добавьте разгрунт к образцам КК. Cap трубки и вихрь смеси.
Обойти предварительно взвешенный хлорид натрия в трубку А и вихрь смешать три раза в течение восьми до 12 секунд. Затем протрите внешние поверхности флакона стойки, содержащей трубку А с использованием 70%изопропанола. После удаления образцов из шкафа биобезопасности, центрифуга трубки А в 1200 раз G в течение одной минуты, чтобы отделить aqueous и ацетонитрил фазы.
Pipette 0.8 миллилитров верхней фазы ацетонитрила в трубку B, используя 100 до 1000 микролитров воздуха водоизмещения пипетки. Перенесите оставшееся раствор в трубку А на опасные отходы и выбросьте пустую трубку в биоопасный контейнер для отходов. Теперь удалите ацетонитрил и трифтороацетик из трубки В с нежным потоком азотного газа в водяной бане по 45 градусов по Цельсию.
Добавьте 0,25 миллилитров ацетонитрила в трубку B с помощью повторного пипетора и вихревой смеси в течение четырех-пяти секунд. Затем центрифуга в 1200 раз G в течение двух-четырех секунд, чтобы собрать жидкость в нижней части трубки. После центрифугации добавьте 0,75 миллилитров ультра-чистой деионизированной воды в трубку B с помощью повторного пипетки с пятими миллилитровой мощностью наконечника и вихревой смеси в течение четырех-пяти секунд.
Центрифуга при 1200 раз G в течение одной минуты, чтобы прояснить образец. Затем перенесите 0,75 миллилитров супернатанта на флакон автоотборника с помощью трубоотвода водоизмещением воздуха 1000 микролитров и выбросьте наконечники пипеток в контейнере для биологических отходов. Cap каждый авто сэмплер флакон надежно для LC-MS / MS анализа.
Перенесите оставшийся раствор в трубку B на опасные отходы и выбросьте пустую трубку в биоопасный контейнер для отходов. Настройте LC-MS/MS со всеми параметрами, описанными в текстовом протоколе. Питание на LC-MS/MS и позволяет столбецу достичь 70 градусов по Цельсию, прежде чем установить скорость потока до 0,8 миллилитров в минуту.
Настройка последовательности в программном обеспечении для сбора данных для введения стандартной кривой до и после каждой партии, состоящей из образцов контроля качества и неизвестных образцов. Ввините все стандарты и образцы и приобретете МР-ионные хроматограммы с использованием параметров, перечисленных в текстовом протоколе. После завершения последовательности выключите LC-MS/MS и утилизировать все автосборопродувные флаконы в опасных отходах.
Ионная хроматограмма контрольной мангузной сыворотки иллюстрирует время удержания этил-АПИ и отсутствие метил-МПА в указанное время удержания. Ионная хроматограмма образца контроля качества иллюстрирует базовое отделение метил-АПИ от этил-АПИ, а также количественные и квалификационные переходы для метил-АПИ. Ионная хроматограмма репрезентативного образца исследования показывает наблюдаемую концентрацию сыворотки в 33,5 микрограмма на микролитер метил-МПА.
Здесь показаны точность и точность результатов контроля мангустной сыворотки, обогащенной метил-АПИ. Процентное восстановление варьировалось от 96,9 до 109%Процентное относительное отклонение на трех уровнях укрепления составило 3,4%1,7% и 2,3% соответственно. Здесь показаны точность и точность результатов контроля мангустной сыворотки, обогащенной этил-АПИ.
Процентное восстановление варьировалось от 89,5 до 115%Процентное относительное стандартное отклонение на пяти уровнях фортификационных сооружений составило 4,3%1,5%2,3%5,6% и 1,1% соответственно. Все мангусты предлагали этил-IPA и метил-IPA приманки потребляется по крайней мере 25% приманки в течение 24 часов ограничения времени и количественно уровней этил-IPA и метил-IPA в их сера, соответственно. Потенциальная полезность метода может быть увеличена путем настройки LC-MS для сбора данных для других аналогов иофеноксической кислоты, таких как пропил и бутил-иофеноксовая кислота.
Мы призвали персонал ознакомиться с самыми последними рекомендациями консультативного комитета по практике иммунизации или их институционального комитета по биобезопасности для руководства по вопросу о том, требуется ли предэкспозиционная вакцинация против бешенства. Разделы 2.3 до 2.6 этого протокола, включающие работу с неразбавленной сывороткой, должны выполняться в кабинете биобезопасности второго класса.
