Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker

Wir haben ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Jophenoxsäure im Mongoserum skizziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Iophenoxsäure als biologischer Marker verwendet werden kann, um die Beta-Aufnahme bei der Art zu überprüfen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie die Quantifizierung von Iophenoxsäure-Analogen in Teilen pro Milliarde Ebenen ermöglicht, mit einer einfachen Proteinfälltechnik.

Kombinieren Sie für die mobile Phase A einen Milliliter Ameisensäure mit einem Liter reinem Ultrawasser. Kombinieren Sie für die mobile Phase B einen Milliliter Ameisensäure mit einem Liter Acetonitril. Kombinieren Sie für das Verdünnungsmittel einen Milliliter Trifluoressigsäure mit 200 Milliliter Acetonitril.

Als nächstes wiegen etwa 10 Milligramm Methyl-IPA auf Mikrobilanz, und erfassen Sie die Masse auf plus oder minus 0001 Milligramm. Übertragen Sie den Methyl-IPA quantitativ auf einen 10 Milliliter-Volumenkolben der Klasse A mit vier bis fünf Milliliteracetonitril. Beschallen Sie für eine Minute, um alle Feststoffe aufzulösen und dann mit Acetonitril zu Volumen zu bringen.

Etwa acht Milliliter pro Lager auf acht Milliliter Bernsteinglasfläschchen mit PTFE-gefütterten Kappen übertragen und die Proben bei Raumtemperatur lagern. Dann den Restbestand in gefährliche Abfälle überführen. Für die 25X-Bestände bereiten sieben Methyl-IPA-Bestände einen Vorrat an Methyl-IPA und Acetonitril mit etwa 200 Mikrogramm pro Milliliter vor.

Einen Milliliter des Vorrats auf einen Fünf-Milliliter-Kolben übertragen und mit Acetonitril auf Volumen verdünnen. Dann den Vorrat in eine acht Milliliter Bernsteinglas-Durchstechflasche mit einer PTFE-gefütterten Kappe übertragen und bei Raumtemperatur lagern. Mit einem Wiederholungspipettor die sechs zusätzlichen 25-fachen Methyl-IPA-Bestände, die im Textprotokoll beschrieben sind, in acht Milliliter-Bernsteinglasfläschchen mit PTFE-gefütterten Kappen vorzubereiten und bei Raumtemperatur aufzubewahren.

Für den 25-fachen Ersatzstoff 0,1 Milliliter des konzentrierten Ethyl-IPA-Bestands mit einer 100-Mikroliter-Glasspritze auf einen 10-Milliliter-Volumenkolben der Klasse A übertragen und dann mit Acetonitril zu Volumen verdünnen. Etwa acht Milliliter des Ersatzteils auf eine acht Milliliter Bernsteinglas-Durchstechflasche mit PTFE-gefütterter Kappe übertragen und bei Raumtemperatur lagern. Den Restbestand in gefährliche Abfälle übertragen.

Als nächstes bereiten Sie 4X-Bestände vor, die sowohl Methyl-IPA als auch Ethyl-IPA in 10 Milliliter-Schraubglas-Auto-Sampler-Fläschchen enthalten, wie im Textprotokoll beschrieben. Um beispielsweise den Lagerwagen 4X7 vorzubereiten, fügen Sie 0,2 Milliliter des 25-Fach-Lagers sieben Methyl-IPA-Lagers zu einer Zwei-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, indem Sie den Repeat Pipettor mit einer 0,5-Milliliter-Kapazität verwenden. Fügen Sie 0,2 Milliliter des 25X Ersatz-Ethyl-IPA-Lagers mit einem Repeat Pipettiermitt mit einer 0,5-Milliliter-Kapazitätsspitze hinzu.

Fügen Sie 0,85 Milliliter Acetonitril mit einem Repeat Pipettor mit einer 1 Milliliter Kapazität Spitze. Die Durchstechflasche sicher und fünfmal invertieren, um sie zu mischen. Bereiten Sie anschließend die Standardkurve in zwei Milliliter-Schraub-Top-Auto-Sampler-Fläschchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um beispielsweise Standard sieben vorzubereiten, fügen Sie 0,2 Milliliter des 4X7-Lagers zu einer Zwei-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, indem Sie einen Wiederholtpipettor mit einer 0,5-Milliliter-Kapazität verwenden. Fügen Sie 0,6 Milliliter ultrareinheitsionisiertes Wasser mit einem Repeat Pipettor mit einer 1 Milliliter-Kapazitätsspitze hinzu. Die Fläschchen sicher und fünfmal invertieren, um sie zu mischen.

Für jede Probe ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 200 bis 300 Milligramm Natriumchlorid zubereiten und die Rohre in einem 80-Positionen-Kunststoffregal anordnen. Etikettieren Sie für jede Probe ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr als A und ein zweites Mikrozentrifugenrohr als B.Arrange the tubes in a 80 position plastic rack. Legen Sie die folgenden Materialien und Ausrüstungen für die Serumextraktion in einen Biosicherheitsschrank der Klasse zwei: die Mikrozentrifugenrohre, einen Wirbelmischer, einen Repeat Pipettiergerät mit 0,5 Milliliter und fünf Milliliter Fassungsspitzen, eine 100 bis 1000 Mikroliter Luftverdrängungspipette mit 1000 Mikroliter Spitzen, Behälter mit jeweils ca. 100 Milliliter n.V. verdünntem und ultrareiniger ionisiertes Wasser und Biorisikobehälter.

Als nächstes entfernen Sie Serumproben aus der tiefgefrorenen Lagerung und wärmen Sie sich auf Raumtemperatur im Biosicherheitsschrank. Wirbel mischen Sie jede Serumprobe vor der Probenahme. Mit einem Repeat Pipettor mit einer 0,5-Milliliter-Kapazitätsspitze 05 Milliliter Mongoserum in Tube A geben und 05 Milliliter des 25-fachen Ersatzstocks hinzufügen.

Dann fügen Sie 0,95 Milliliter Verdünnungsmittel zu Rohr A mit einem Repeat Pipettor mit einer Fünf-Milliliter-Kapazitätsspitze. Die Rohre sicher verkapseln und 10 bis 15 Sekunden lang wirbeln. Als Nächstes fügen Sie das Kontrollmongooseserum zu Tube A.Fortify jede der 4QC-Proben mit me-IPA mit einem Repeat Pipettor mit einer 0,5 Milliliter Kapazität Spitze.

Fügen Sie den QC-Proben 25-fache Ersatzbestände hinzu. Fügen Sie dann das Verdünnern zu den QC-Proben hinzu. Kappen Sie die Rohre und Wirbel mischen.

Das vorgewogene Natriumchlorid in Tube A geben und dreimal für acht bis zwölf Sekunden mischen. Wischen Sie dann die Außenflächen des Durchstechflaschels mit Rohr A mit 70% Isopropanol ab. Nach dem Entfernen der Proben aus dem Biosicherheitsschrank, Zentrifugenrohr A bei 1200 mal G für eine Minute, um die wässrigen und Acetonitril-Phasen zu trennen.

Pipette 0,8 Milliliter der oberen Acetonitrilphase zu Tube B, mit einer 100 bis 1000 Mikroliter Luftverschiebungspipette. Die restliche Lösung in Rohr A in gefährliche Abfälle geben und das leere Rohr in einem biogefährlichen Abfallbehälter entsorgen. Entfernen Sie nun Acetonitril und Trifluoresestik aus Röhre B mit einem sanften Fluss von Stickstoffgas in einem 45 Grad Celsius Wasserbad.

Fügen Sie 0,25 Milliliter Acetonitril in Tube B mit einem Repeat Pipettor und Wirbelmischung für vier bis fünf Sekunden. Dann Zentrifuge bei 1200 mal G für zwei bis vier Sekunden, um die Flüssigkeit in der Unterseite des Rohres zu sammeln. Nach der Zentrifugation 0,75 Milliliter ultrareines deionisiertes Wasser mit einem Repeat Pipettor mit einer Fünf-Milliliter-Kapazität und Wirbelmischung für vier bis fünf Sekunden in Tube B hinzufügen.

Zentrifuge bei 1200 mal G für eine Minute, um die Probe zu klären. Dann 0,75 Milliliter des Überstandes mit einer 1000-Mikroliter-Luftverdrängungspipette in eine Auto-Probe-Durchstechflasche geben und die Pipettenspitzen im Biohazard-Abfallbehälter entsorgen. Kappen Sie jede Auto-Sampler-Durchstechflasche sicher für die LC-MS/MS-Analyse.

Die restliche Lösung in Rohr B in gefährliche Abfälle geben und das leere Rohr in einem Biogefahrabfallbehälter entsorgen. Konfigurieren Sie den LC-MS/MS mit allen im Textprotokoll beschriebenen Parametern. Schalten Sie den LC-MS/MS ein und lassen Sie die Säule 70 Grad Celsius erreichen, bevor Sie den Durchfluss auf 0,8 Milliliter pro Minute einstellen.

Richten Sie eine Sequenz in der Datenerfassungssoftware ein, um die Standardkurve vor und nach jedem Stapel zu injizieren, die aus Qualitätskontrollproben und unbekannten Proben besteht. Injizieren Sie alle Normen und Proben und erfassen Sie MR-Ionenchromatogramme anhand der im Textprotokoll aufgeführten Parameter. Schalten Sie nach Abschluss der Sequenz den LC-MS/MS aus und entsorgen Sie alle Auto-Probenehmer-Fläschchen in gefährlichen Abfällen.

Das Ionenchromatogramm des Kontrollmongooseserums veranschaulicht die Retentionszeit von Ethyl-IPA und das Fehlen von Methyl-IPA zur angegebenen Retentionszeit. Das Ionenchromatogramm der Qualitätskontrollprobe veranschaulicht die Basistrennung von Methyl-IPA von Ethyl-IPA sowie die Quantifizier- und Qualifiziererübergänge für Methyl-IPA. Das Ionenchromatogramm der repräsentativen Probe aus der Studie zeigt eine beobachtete Serumkonzentration von 33,5 Mikrogramm pro Mikroliter Methyl-IPA.

Die Genauigkeits- und Präzisionsergebnisse für mit Methyl-IPA angereichertes Kontrollmangusteserum werden hier gezeigt. Die prozentuale Erholung lag zwischen 96,9 und 109 %Die relative Abweichung von 3,4 % betrug 3,4 %1,7 % bzw. 2,3 %. Die Genauigkeits- und Präzisionsergebnisse für mit Ethyl-IPA angereichertes Kontrollmangusteserum werden hier gezeigt.

Die prozentuale Erholung reichte von 89,5 bis 115%Die relative Standardabweichung von 4,3% betrug 4,3%1,5%2,3%5,6% bzw. 1,1%. Alle Gänse, die Ethyl-IPA- und Methyl-IPA-Köder anboten, verbrauchten innerhalb der 24-Stunden-Zeitbeschränkung mindestens 25 % des Köders und wiesen quantifizierbare Ethyl-IPA- und Methyl-IPA-Werte in ihren Seren auf. Der potenzielle Nutzen der Methode könnte erhöht werden, indem der LC-MS so konfiguriert wird, dass Daten für andere Iophenoxsäureanaloga wie Propyl- und Butyl-Iophenoxsäure gesammelt werden.

Wir haben das Personal aufgefordert, die jüngsten Empfehlungen des Beratenden Ausschusses für Impfpraktiken oder seines institutionellen Ausschusses für biologische Sicherheit zu konsultieren, um Zusagen zu erhalten, ob eine Vorexpositionsimpfung für Tollwut erforderlich ist. Die Abschnitte 2.3 bis 2.6 dieses Protokolls, das die Arbeit mit unverdünntem Serum beinhaltet, sollten in einem Biosicherheitsschrank der Klasse 2 durchgeführt werden.