此方法允许通过非侵入性方法检测结肠直肠肿瘤病变患者。特别是，这项测试允许，与目前用于结肠直肠癌筛查计划的测试，以更好地预测癌症的存在或异常病变的较高风险。为了开始此协议，在小型离心机上以干燥格式将每个正对照、标准DNA和尖峰DNA的等分分离10秒钟。
用 750 微升水重新暂停正控。重新使用尖峰DNA，用作外源性内部控制，以测试抑制剂的存在，用100微升水。对于标准曲线，用 100 微升水重新暂停干燥标准，然后从库存溶液开始进行四个 1：5 稀释。
然后，小心地旋转试剂15秒，并在微型离心机中离心机中离心机10秒。要进行完全的再暂停，请将液体试剂在室温下存放 30 分钟，然后再使用。为了准备1倍尖峰DNA控制，将5微升FL-DNA尖峰与45微升无菌水混合。
对于样品，将每个样品的75微升与50微升的1倍尖峰DNA混合，产生125微升的总体积。首先，打开 qPCR 操作软件。要设置板，请将第一栏中所有八个位置的井型设置为标准。
将 A2 和 B2 油井的井型设置为 NTC。将正控件 C2 和 D2 的井类型设置为"未知"。并设置所有其他位置的井类型为"未知"。
选择所有 96 个职位。添加染料、FAM 和 HEX，然后单击"同步板"。然后设置热配置文件，如提供。
准备所需数量的8井条，其中包含完整的冻干扩增混合物，并针对特定的用于人类DNA和内部控制的特定底剂和探针。要将内装物放在管的底部，请将条形离心 10 秒钟。轻轻地从条子上取下密封件，确保不会丢失任何颗粒。
然后在负控制井中加入25微升水。25微升样品DNA样本井和25微升正对照DNA对正控制井。对于标准曲线，在每个专用井中添加 25 个标准 1、2、3 和 4 微升。
使用 8 条扁平光盖小心地关闭所有条带和涡流几秒钟。将条形离心 10 秒钟，将它们加载到仪器中，然后开始运行。在运行结束时，对于 FAM FL-DNA A 和 HEX IC，选择列、A、C、E 和 G.对于 FAM FL-DNA B 和 HEX IC，选择列、B、D、F 和 H.对于标准数量的起始量，为 A1 和 B1 孔设置 10 个 nanogram，为 C1 和 D1 选择每个反应 2 个 nanogram，对于 E1 和 F1 的每个反应设置 4 个 nanogram，并且 G1 和 H1 的每个反应点为零 8 南图。然后，对于 FAM 和 HEX 通道，将阈值荧光值设置为 150。
在"结果表"框中，单击"列选项"，然后"选择全部"，然后"确定"，以获取两个通道中的结果，这些通道具有各自的 Cq 和增量 R 最后值，这些值由实时 qPCR 仪器软件提供。增量 R 最后对应于与最后一个放大周期规范化的荧光值。在"结果表"框中，右键单击表以打开上下文菜单。
单击"发送到 Excel"导出原始数据。然后上传 Excel 文件到专用分析软件上，以自动计算 FL-DNA 数量。从 iFOBT 和 FL-DNA 值对每个患者的估计相结合，结肠直肠癌的风险。
合适的正样本的荧光曲线在可接受的范围内显示 HEX 通道（即内部控制）上的样本信号。正信号高于 FAM 通道的阈值，显示目标基因的放大。合适的负样本的荧光曲线显示 HEX 通道上可接受的范围内的样本信号。
负控制信号低于 FAM 通道的阈值。另一方面，不适合的样本的曲线显示的样本信号不在 HEX 通道上的可接受范围内。很可能是由于潜在的抑制。
因此，必须从提取开始重复此示例。软件分析输出表显示 Mix A 和 Mix B 在反应控制、临床样本和运行质量控制结果的 FL-DNA 浓度方面的数据。样本四没有任何结果，因为它没有通过质量控制。
必须重复和重新分析它。将用于尖峰控制的控制的 DNA 重新用于标准曲线时，请小心。当将不同的DNA分布到8井条时，以及在结果分析部分的分子检测过程中。
此方法必须与 iFOBT 测试相结合进行，以便更好地评估结肠直肠肿瘤病变，必须使用相同的粪便样本进行。
