이 방법은 비침습적 접근법에 의해, 대장 신생물 성병증을 가진 환자를 검출하는 것을 허용합니다. 특히, 이 시험은 현재 대장암 검진 프로그램에서 사용되는 검사와 연계하여 암의 존재 또는 비정상적인 병변의 위험이 더 높은 것을 더 잘 예측할 수 있도록 허용합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 각 양성 제어, 표준 DN 및 스파이크 인 DNA의 알리쿼트를 미니 원심 분리기에서 10 초 동안 건조한 형식으로 알리쿼트합니다.
750 마이크로리터의 물로 양수 제어를 다시 중단합니다. 외인성 내부 제어로 사용되는 스파이크 인 DNA를 다시 중단하고 100 마이크로 리터의 물로 억제제의 존재를 테스트합니다. 표준 곡선의 경우 100 마이크로리터의 물로 건식 표준을 다시 중단하고 스톡 솔루션에서 시작하여 4 개의 1:5 희석을 만듭니다.
그런 다음 시약을 15초 동안 조심스럽게 소용돌이게 하고 원심분리기를 미니 원심분리기에서 10초 간 조심스럽게 소용돌이시다. 완전한 리서스펜션을 위해 액체 시약을 실온에서 30분 간 보관하십시오. 1x 스파이크 인 DNA 제어를 준비하려면 FL DNA 스파이크 5 마이크로리터와 멸균 수 45 마이크로리터를 혼합합니다.
시료의 경우 각 샘플의 75마이크로리터를 1x 스파이크인 DNA 50마이크로리터와 혼합하여 총 125마이크로리터를 생성합니다. 먼저 qPCR 운영 소프트웨어를 엽니다. 플레이트를 설정하려면 열 1의 8개 위치에 대해 Well Type을 표준으로 설정합니다.
A2 및 B2 웰에 대한 웰 유형을 NTC로 설정합니다. 양수 컨트롤인 C2 및 D2에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로 설정합니다. 그리고 알 수없는 다른 모든 위치에 대한 웰 유형을 설정합니다.
96개의 위치를 모두 선택합니다. 염료, FAM 및 HEX를 추가하고 동기화 플레이트를 클릭합니다. 그런 다음 제공된 대로 열 프로파일을 설정합니다.
인체 DNA를 대상으로 하는 특정 프라이머 및 프로브와 함께 완전한 리오필화 증폭 혼합물을 포함하는 8웰 스트립의 원하는 수를 준비하고 내부 제어를 준비한다. 내용물의 내용을 튜브 바닥에 가져오려면 스트립을 10초 동안 원심분리합니다. 스트립에서 씰을 부드럽게 제거하여 펠릿을 잃지 않도록 하십시오.
그런 다음 음의 제어 우물에 25 마이크로 리터의 물을 추가합니다. 우물을 샘플링하는 샘플 DNA의 25 마이크로리터와 양성 제어 우물에 양성 대조군 DNA의 25 마이크로리터. 표준 곡선의 경우 각 전용 웰에 표준 1, 2, 3 및 4의 마이크로리터 25개를 추가합니다.
8 스트립 플랫 광학 캡을 사용하여 몇 초 동안 모든 스트립과 소용돌이를 조심스럽게 닫습니다. 스트립을 10초 동안 원심분리하고 계측기에 로드한 다음 실행을 시작합니다. 실행의 끝에서, FAM FL DNA A 및 HEX IC에 대 한, 선택 컬럼, A, C, E, 그리고 G.FOR FAM FL-DNA B 및 HEX IC, 선택 열, B, D, F, 그리고 H.표준 수량 시작 량에 대 한, 설정 10 나노 그램 A1 및 B1 우물에 대 한 반응 당, C1 및 4 1 에 대 한 반응 당 2 나노 그램, 4 나노 그램 반응 당 반응 당 , G1 및 H1에 대한 반응 당 8 나노그램을 가리킵니다. 그런 다음 FAM 및 HEX 채널 모두 임계값형광값을 150으로 설정합니다.
상자 결과 테이블에서 열 옵션을 클릭한 다음 모두 를 선택한 다음 확인을 선택하여 실시간 qPCR 계측기 소프트웨어에서 제공하는 각 Cq 및 델타 R 마지막 값으로 두 채널모두에서 결과를 가져옵니다. 델타 R 은 마지막 증폭 주기로 정규화된 형광 값에 해당합니다. 상자 결과 테이블에서 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 컨텍스트 메뉴를 엽니다.
원시 데이터를 내보내려면 Excel로 보내기를 클릭합니다. 그런 다음 FL-DNA 수량의 자동화된 계산을 위해 전용 분석 소프트웨어에 Excel 파일을 업로드합니다. iFOBT와 FL-DNA 값의 조합에서 각 환자에 대 한 추정, 대장 암 위험.
적합한 양수 샘플의 형광 곡선은 허용 가능한 범위 내에서 내부 제어인 HEX 채널의 샘플 신호를 보여줍니다. 양성 신호는 표적 유전자의 증폭을 보여주는 FAM 채널의 임계값 이상입니다. 적합한 음수 샘플의 형광 곡선은 HEX 채널의 허용 범위 내에서 샘플 신호를 표시합니다.
음수 제어 신호는 FAM 채널의 임계값 보다 낮습니다. 한편, 적합하지 않은 샘플의 곡선은 HEX 채널에서 허용 가능한 범위 내에 있지 않은 샘플 신호를 표시합니다. 잠재적인 억제로 인해 가장 가능성이 높습니다.
따라서 이 샘플은 추출부터 시작하여 반복되어야 합니다. 소프트웨어 분석 출력 표는 반응 제어, 임상 샘플 및 실행 품질 관리 결과를 위한 FL-DNA 농도 측면에서 혼합 A 및 혼합 B 모두에 대한 데이터를 보여줍니다. 샘플 번호 4는 품질 관리를 통과하지 못했기 때문에 결과가 없습니다.
반복하고 다시 분석해야 합니다. 표준 곡선에 스파이크 인 제어에 대한 DNA를 다시 일시 중단 할 때주의하시기 바랍니다. 및 다른 DNA를 8웰 스트립에 분배할 때, 뿐만 아니라 결과 분석 섹션에서 분자 검출 중에.
이 방법은 대장 신플라스틱 병변의 더 나은 평가를 허용하기 위해 iFOBT 테스트와 함께 수행되어야하며, 동일한 배설물 샘플로 수행되어야한다.
