この方法は、非侵襲的アプローチによって、大腸新生病変を有する患者を検出することを可能にする。特に、この検査は、結腸直腸癌スクリーニングプログラムで現在使用されている検査に関連して、癌または異常病変のリスクの高い存在をより良く予測することを可能にする。このプロトコルを開始するために、各正の対照、標準のDNA、およびスパイクインDNAのアリコートを、ミニ遠心分離機で10秒間乾燥した形式で遠心分離する。
750マイクロリットルの水で正のコントロールを再中断します。外因性の内部制御として使用されるスパイクインDNAを再懸濁し、100マイクロリットルの水で阻害剤の存在を試験する。標準曲線の場合、100マイクロリットルの水で乾燥規格を再中断し、ストック溶液から始まる4つの1:5希釈液を作ります。
次いで、試薬を15秒間慎重にボルテックスし、遠心分離機をミニ遠心分離機で10秒間慎重にボルテックスします。完全な再懸濁液のために、使用する前に30分間室温で液体試薬を保管してください。1xスパイクインDNA制御を準備するには、FL-DNAスパイクの5マイクロリットルと45マイクロリットルの無菌水を混合します。
サンプルの場合、各サンプルの75マイクロリットルを1xスパイクインDNAの50マイクロリットルと混合し、合計体積125マイクロリットルを生成します。まず、qPCR オペレーティング ソフトウェアを開きます。プレートを設定するには、列 1 の 8 つの位置すべてに対して[標準タイプ]を[標準]に設定します。
A2 ウェルと B2 ウェルのウェルタイプを NTC として設定します。正のコントロールの [ウェル タイプ] を [不明] に設定します。その他のすべてのポジションのウェルタイプを[不明]に設定します。
96 のポジションをすべて選択します。染料、FAM、HEXを追加し、[同期プレート]をクリックします。次に、温度プロファイルを設定します(提供)。
完全な凍結乾燥増幅混合物を含む8ウェルストリップの所望の数を調製し、ヒトDNAを標的とする特定のプライマーおよびプローブ、および内部制御を行う。チューブの底に内容物を持って来るために、10秒間ストリップを遠心分離します。細片からシールをそっと取り除き、ペレットを失わないようにします。
その後、負のコントロールウェルに25マイクロリットルの水を加えます。サンプルDNAを25マイクロリットルサンプルウェルに、陽性対照DNAを陽性対照井戸に25マイクロリットル。標準曲線の場合は、各専用ウェルに標準 1、2、3、および 4 の 25 マイクロリットルを追加します。
8ストリップフラット光キャップを使用して、数秒間、すべてのストリップと渦を慎重に閉じます。ストリップを10秒間遠心分離し、機器にロードして実行を開始します。実行の最後に、FAM FL-DNA AおよびHEX ICの場合、選択列、A、C、E、およびG.のFAM FL-DNA BおよびHEX ICについて、選択列、B、D、F、およびH.標準量開始量については、A1およびB1ウェルの反応ごとに10ナノグラムを設定し、C1およびD1の反応あたり2ナノグラム、G1およびH1に対する反応ごとに8ナノグラムをポイントする。次に、FAM チャネルと HEX チャネルの両方で、しきい値蛍光値を 150 に設定します。
「結果表」ボックスで、「列オプション」をクリックしてから、「すべて選択」をクリックしてから「オーケー」をクリックし、リアルタイム qPCR 計測器ソフトウェアによって提供されるそれぞれの Cq およびデルタ R の最終値を持つ両方のチャネルの結果を取得します。ΔRは最後の増幅サイクルに正規化された蛍光値に対応する。[結果テーブル] ボックスでテーブルを右クリックし、コンテキスト メニューを開きます。
未処理データをエクスポートするには、[Excel に送信] をクリックします。そして、FL-DNA量の自動計算のための専用の分析ソフトウェアにExcelファイルをアップロードします。iFOBTとFL-DNA値の組み合わせから、各患者の推定、大腸癌リスク。
適切な陽性サンプルの蛍光曲線は、許容範囲内の内部制御であるHEXチャネル上のサンプル信号を示す。陽性シグナルは、FAMチャネル上の閾値を超え、これは標的遺伝子の増幅を示す。適当な陰性サンプルの蛍光曲線は、HEXチャネル上の許容範囲内のサンプル信号を示す。
負の制御信号が FAM チャネルのしきい値を下回っています。一方、適当でないサンプルの曲線は、HEXチャネル上で許容範囲内にないサンプル信号を示す。潜在的な阻害による可能性が最も高い。
したがって、このサンプルは抽出から始めて繰り返す必要があります。ソフトウェア分析出力表は、反応制御、臨床サンプル、および実行品質管理結果に対するFL-DNA濃度の観点から、ミックスAとミックスBの両方のデータを示しています。サンプル番号 4 は、品質管理に合格していないため、結果を持つません。
繰り返し、再分析する必要があります。スパイクイン制御用DNAを標準曲線に再懸濁する際はご注意ください。そして、異なるDNAを8ウェルストリップに配布する場合と、結果分析セクションでの分子検出中に同様。
この方法は、大腸新生病変のより良い評価を可能にするためにiFOBT試験と組み合わせて行わなければならない、それは同じ便サンプルで行われなければならない。
