Cette méthode permet de détecter, par une approche non invasive, le patient présentant la lésion néoplastique côlorectal. En particulier, ce test permet, en association avec les tests actuellement utilisés dans le cadre d’un programme de dépistage du cancer colorectal, de mieux prédire la présence d’un cancer ou un risque plus élevé de lésions anormales. Pour commencer ce protocole, centrifugez un aliquot de chaque contrôle positif, ADN standard, et spike-in ADN, dans un format sec pendant 10 secondes sur une mini centrifugeuse.
Resuspendez le contrôle positif avec 750 microlitres d’eau. Resuspendez l’ADN spike-in, utilisé comme un contrôle interne exogène, pour tester la présence d’inhibiteurs, avec 100 microlitres d’eau. Pour la courbe standard, resuspendez la norme sèche avec 100 microlitres d’eau et faites quatre dilutions 1:5 à partir de la solution de stock.
Ensuite, vortex soigneusement les reagents pendant 15 secondes, et centrifugeuse dans une mini centrifugeuse pendant 10 secondes. Pour une resuspension complète, conserver les réaménagements liquides à température ambiante pendant 30 minutes avant de les utiliser. Pour préparer le 1x spike-in DNA control, mélanger cinq microlitres de pointe FL-ADN avec 45 microlitres d’eau stérile.
Pour les échantillons, mélanger 75 microlitres de chaque échantillon avec 50 microlitres d’ADN 1x spike-in, ce qui donne un volume total de 125 microlitres. Tout d’abord, ouvrez le logiciel d’exploitation qPCR. Pour configurer la plaque, définissez le type de puits pour les huit positions de la première colonne, sous le nom de Standard.
Réglez le type de puits pour les puits A2 et B2 en tant que CNT. Définissez le type de puits pour les contrôles positifs, C2 et D2, comme inconnu. Et définissez le type de puits pour toutes les autres positions comme inconnues.
Sélectionnez les 96 postes. Ajouter les edes, FAM et HEX et cliquez sur Sync Plate. Réglez ensuite le profil thermique, tel que fourni.
Préparez le nombre désiré de bandes de 8 puits contenant des mélanges complets d’amplification lyophilisée, avec des amorces et des sondes spécifiques ciblant l’ADN humain et le contrôle interne. Pour amener le contenu au fond des tubes, centrifugez les bandes pendant 10 secondes. Retirer délicatement les joints des bandes, en s’assurant de ne pas perdre de granulés.
Ajouter ensuite 25 microlitres d’eau aux puits de contrôle négatifs. 25 microlitres d’ADN échantillon pour échantillonner les puits et 25 microlitres d’ADN de contrôle positif aux puits de contrôle positifs. Pour la courbe standard, ajouter 25 microlitres de norme 1, 2, 3 et 4 dans chaque puits dédié.
Utilisez des bouchons optiques plats à 8 bandes pour fermer soigneusement toutes les bandes et vortex pendant quelques secondes. Centrifugez les bandes pendant 10 secondes, chargez-les dans l’instrument et démarrez la course. À la fin de la course, pour FAM FL-DNA A et HEX IC, sélectionnez colonnes, A, C, E et G.Pour FAM FL-DNA B et HEX IC, sélectionnez colonnes, B, D, F et H.Pour les quantités standard de départ, réglez 10 nanogrammes par réaction pour les puits A1 et B1, deux nanogrammes par réaction pour C1 et D1, point quatre nanogrammes par réaction pour E1 et F1 , et point zéro huit nanogrammes par réaction pour G1 et H1. Ensuite, pour les canaux FAM et HEX, les valeurs de fluorescence seuil sont fixées à 150.
Dans la table de résultat de la boîte, cliquez sur Options colonne, puis Sélectionnez tous, puis Ok, pour obtenir les résultats dans les deux canaux avec leurs valeurs respectives Cq et delta R dernières, qui sont fournis par le logiciel d’instrument qPCR en temps réel. Delta R correspond pour la dernière fois à la valeur de fluorescence normalisée au dernier cycle d’amplification. Dans la table de résultat de la boîte, cliquez à droite sur la table pour ouvrir le menu contexte.
Cliquez sur Envoyer à Excel pour exporter les données brutes. Et puis télécharger le fichier Excel sur le logiciel d’analyse dédié pour le calcul automatisé de la quantité fl-ADN. À partir de la combinaison de l’estimation des valeurs iFOBT et FL-ADN pour chaque patient, le risque de cancer colorectal.
Les courbes de fluorescence d’un échantillon positif approprié montrent le signal de l’échantillon sur le canal HEX, qui est le contrôle interne, dans la plage acceptable. Le signal positif est au-dessus du seuil sur le canal FAM, qui montre l’amplification des gènes cibles. Les courbes de fluorescence d’un échantillon négatif approprié montrent le signal de l’échantillon dans la plage acceptable sur le canal HEX.
Le signal de contrôle négatif est inférieur au seuil sur le canal FAM. D’autre part, les courbes d’un échantillon non approprié montrent le signal de l’échantillon qui n’est pas dans la plage acceptable sur le canal HEX. Très probablement en raison d’une inhibition potentielle.
Par conséquent, cet échantillon doit être répété, à partir de l’extraction. Le tableau de sortie d’analyse logicielle montre les données pour le mélange A et le mélange B en termes de concentration de FL-ADN pour les contrôles de réaction, les échantillons cliniques et les résultats de contrôle de la qualité. L’échantillon numéro quatre n’a pas de résultats parce qu’il n’a pas passé le contrôle de la qualité.
Il doit être répété et réanalysé. S’il vous plaît être prudent lors de la réutilisation de l’ADN pour spike-in dans le contrôle de la courbe standard. Et lors de la distribution de différents ADN à des bandes de 8 puits, ainsi que lors de la détection moléculaire dans la section d’analyse des résultats.
Cette méthode doit être effectuée en combinaison avec le test iFOBT pour permettre une meilleure évaluation des lésions néoplastiques colorectales, il doit être effectué avec le même échantillon fécal.
