Este método permite detectar, por uma abordagem não invasiva, paciente com lesão neoplásica colorretal. Em particular, este teste permite, em associação com os testes atualmente utilizados no programa de rastreamento de câncer colorretal, prever melhor a presença de câncer ou maior risco de lesões anormais. Para iniciar este protocolo, centrifugar uma alíquota de cada controle positivo, DNAs padrão e DNA spike-in, em um formato seco por 10 segundos em uma mini centrífuga.
Resuspene o controle positivo com 750 microliters de água. Resuspend o DNA de espigão, usado como controle interno exógeno, para testar a presença de inibidores, com 100 microlitres de água. Para a curva padrão, resuspenque o padrão seco com 100 microliters de água e faça quatro diluições de 1:5 a partir da solução de estoque.
Em seguida, cuidadosamente vórtice os reagentes por 15 segundos, e centrífuga em uma mini centrífuga por 10 segundos. Para uma ressuspensão completa, armazene os reagentes líquidos à temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Para preparar o controle de DNA de 1x, misture cinco microliters de pico de DNA FL com 45 microliters de água estéril.
Para as amostras, misture 75 microlitadores de cada amostra com 50 microliters de 1x de DNA, produzindo um volume total de 125 microliters. Primeiro, abra o software operacional qPCR. Para configurar a placa, defina o Tipo de Poço para todas as oito posições na coluna um, como Padrão.
Defina o Tipo de Poço para os poços A2 e B2 como NTC. Defina o Tipo de Poço para os controles positivos, C2 e D2, como Desconhecido. E definir o Tipo de Poço para todas as outras posições como Desconhecido.
Selecione todas as 96 posições. Adicione os corantes, FAM e HEX e clique em Placa de Sincronização. Em seguida, defina o Perfil Térmico, conforme fornecido.
Prepare o número desejado de tiras de 8 poços contendo misturas de amplificação totalmente liofilizadas, com primers e sondas específicas visando o DNA humano, e o controle interno. Para levar o conteúdo para o fundo dos tubos, centrifugar as tiras por 10 segundos. Remova suavemente as vedações das tiras, certificando-se de não perder nenhuma pelota.
Em seguida, adicione 25 microliters de água aos poços de controle negativos. 25 microliters de DNA amostral para amostra de poços e 25 microliters de DNA de controle positivo para os poços de controle positivo. Para a curva padrão, adicione 25 microliters de padrão 1, 2, 3 e 4 em cada poço dedicado.
Use tampas ópticas planas de 8 tiras para fechar cuidadosamente todas as tiras e vórtices por alguns segundos. Centrifugar as tiras por 10 segundos, carregá-las no instrumento e iniciar a corrida. No final da corrida, para FAM FL-DNA A e HEX IC, selecione colunas, A, C, E e G.Para FAM FL-DNA B e HEX IC, selecione colunas, B, D, F e H.Para as quantidades padrão de início, defina 10 nanogramas por reação para poços A1 e B1, dois nanogramas por reação para C1 e D1, ponto quatro nanogramas por reação para E1 e F1 , ponto zero oito nanogramas por reação para G1 e H1. Em seguida, tanto para os canais FAM quanto HEX, definir os valores de fluorescência limiar para 150.
Na tabela de resultados da caixa, clique em Opções de Coluna, então, Selecione Tudo e, em seguida, Ok, para obter os resultados em ambos os canais com seus respectivos valores de Cq e delta R, que são fornecidos pelo software de instrumento qPCR em tempo real. O Delta R corresponde ao valor de fluorescência normalizado ao último ciclo de amplificação. Na tabela de resultados da caixa, clique com o botão direito do mouse na tabela para abrir o menu de contexto.
Clique em Enviar para Excel para exportar os dados brutos. E, em seguida, carregar o arquivo Excel no software de análise dedicado para cálculo automatizado da quantidade DE DNA FL. A partir da combinação de valores iFOBT e FL-DNA estimam para cada paciente, o risco de câncer colorretal.
Curvas de fluorescência de uma amostra positiva adequada mostram o sinal amostral no canal HEX, que é o controle interno, dentro da faixa aceitável. O sinal positivo está acima do limiar no canal FAM, que mostra a amplificação dos genes alvo. As curvas de fluorescência de uma amostra negativa adequada mostram o sinal amostral dentro da faixa aceitável no canal HEX.
O sinal de controle negativo está abaixo do limiar no canal FAM. Por outro lado, as curvas de uma amostra não adequada mostram o sinal de amostra que não está dentro do intervalo aceitável no canal HEX. Provavelmente devido a uma possível inibição.
Portanto, esta amostra deve ser repetida, a partir da extração. A tabela de saída de análise de software mostra dados tanto para o Mix A quanto para o Mix B em termos de concentração de DNA FL para controles de reação, amostras clínicas e resultados de controle de qualidade de execução. A amostra número quatro não tem resultados porque não passou pelo controle de qualidade.
Deve ser repetido e reanalisado. Por favor, tenha cuidado quando resuspended o DNA para spike-in no controle para a curva padrão. E ao distribuir diferentes DNAs para tiras de 8 poços, bem como durante a detecção molecular na seção de análise de resultados.
Este método deve ser realizado em combinação com o teste iFOBT para permitir uma melhor avaliação das lesões neoplásicas colorretais, devendo ser realizado com a mesma amostra fecal.
