利用生命病毒介导的人神经元转导研究头塔聚集的体外模型

在该协议中，我们详细介绍了人类肌病的体外模型。这种方法填补了对药物筛选和疾病机制研究有用的材料需求。与动物研究相比，这种技术的主要优点是细胞培养范式能够更快速地评估tau毒性和潜在的tau疗法，开始这个程序在四摄氏度下解冻培养板的基底膜基质涂层。

制作一毫升的等分，并储存在零下20或零下70摄氏度。接下来，以每毫升10微克的浓度重组无菌PBS中的基本成纤维细胞生长因子。制作 10 微升等分，并将其储存在 4 摄氏度。

然后拿出一个新的未开封的500毫升瓶DMEM-F12与谷氨酰胺。加入10毫升B27、5毫升N2和5毫升青霉素链霉素，以准备神经干细胞培养基。将 50 毫升的 NSC 介质放入锥形管中，并加入 10 微升准备好的 bFGF。

将此 NSC 加 bFGF 介质存放在摄氏四度。首先，从冰柜中取出细胞培养板的冷冻基底膜基质涂层，并在四摄氏度下解冻。将解冻的地下室膜基质涂层的385微升加入含有青霉素链霉素的5毫升DMEM-F12介质中。

如果细胞从冷冻的NSC库存中解冻，从冷冻室中取出一小瓶冷冻细胞，在水浴中加热至37摄氏度，在水中来回移动小瓶。在此之后，用70%乙醇喷洒小瓶。然后在细胞培养罩下，将细胞转移到含有青霉素链霉素的DMEM-F12介质中约10毫升。

在室温下在1000次g下离心5分钟。然后吸气介质，并在 NSC 介质中重新暂停细胞。稀释NSC培养基中的细胞，以获得用于细胞培养容器的适当播种密度。

添加足够的悬浮在 NSC 介质中的细胞，为地下室膜基质涂层培养皿播种。在37摄氏度下用5%的二氧化碳生长细胞，直到它们75至80%的汇合，确保每隔一天更换一次介质。要用扁病毒进行神经元的转导，每个细胞使用34万个可转接单位的滴度计数。

将细胞培养培养基中的可变性单位稀释到必要的浓度，并将其添加到细胞中。添加扁病毒两天后，用不含bFGF的新鲜介质清洗细胞一次。在37摄氏度下继续培养细胞，在没有bFGF的介质中培养5%的二氧化碳。

转导后保持细胞约八周，确保每隔一天改变细胞培养培养。使用光学显微镜对细胞进行常规可视化，确保其生存能力。转导后，从培养箱中取出培养皿，确保盖子保持，以保持培养物无菌。

使用能够活细胞成像的荧光显微镜，以 514 纳米的激发和 527 纳米的发射过滤器在 10 倍目标下可视化细胞。在这项研究中，用tau-RDLM-YFP扁病毒转导的神经元被荧光标记与YFP。RDLM 转导培养物在转导后显示聚合。

这些内含物对硫黄素有阳性的污渍。神经元分化通过神经元特异性标记β-图布林III在培养物中的免疫标记得到确认。重要的是要记住，荧光标记的二级抗体应具有不与YFP重叠的激发发射光谱。

虽然在没有染色的情况下，黄色荧光tau聚集物清晰可见，但硫黄素也应用于成像，以确认荧光信号是聚合tau，而不是细胞碎片。在产生tau过度表达细胞后，可以进行一些神经元健康和tau聚合的评估。例如，我们发现这些细胞显示斧神酮退化。

除了细胞培养研究外，我们还使用这种方法来检测致病性外源tau。