Dans ce protocole, nous détailler un modèle in vitro de tauopathie humaine. Cette méthode comble un besoin de matériaux qui peut être utile pour le dépistage des médicaments et les études sur les mécanismes de la maladie. Le principal avantage de cette technique est que le paradigme de la culture cellulaire permet une évaluation plus rapide de la toxicité tau et des thérapeutiques tau potentielles par rapport aux études animales Pour commencer cette procédure décongeler le revêtement matricielle membranaire du sous-sol pour les plaques de culture à quatre degrés Celsius.
Faites des aliquots d’un millilitre et rangez-les à moins 20 ou moins 70 degrés Celsius. Ensuite, reconstituer le facteur de croissance fibroblaste de base dans PBS stérile à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Faire des aliquots de 10 microlitres et les stocker à quatre degrés Celsius.
Ensuite, mettez en place une nouvelle bouteille non ouverte de 500 millilitres de DMEM-F12 avec glutamine. Ajouter 10 millilitres de B27, cinq millilitres de N2 et cinq millilitres de pénicilline-streptomycine pour préparer les cellules souches neurales. Placer 50 millilitres du média NSC dans un tube conique et ajouter 10 microlitres du bFGF préparé.
Stockez ce média NSC plus bFGF à quatre degrés Celsius. Tout d’abord, retirez un aliquot de revêtement matriciel membranaire gelé pour les plaques de culture cellulaire du congélateur et il permet de décongeler à quatre degrés Celsius. Ajouter 385 microlitres du revêtement matriciel membranaire décongelé du sous-sol à cinq millilitres de supports DMEM-F12 contenant de la pénicilline-streptomycine.
Si les cellules sont décongelées à partir de stocks gelés de NSC, prenez un flacon de cellules gelées du congélateur et réchauffez-le dans un bain d’eau chauffé à 37 degrés Celsius en déplaçant le flacon dans l’eau. Après cela, vaporiser le flacon avec 70% d’éthanol. Ensuite, sous un capot de culture cellulaire, transférer les cellules à environ 10 millilitres de DMEM-F12 médias contenant de la pénicilline-streptomycine.
Centrifugeuse à température ambiante à 1000 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez les médias et réutilisez les cellules dans les médias du CNS. Diluer les cellules dans les supports du CNS afin d’obtenir la densité d’ensemencement appropriée pour le vaisseau de culture cellulaire utilisé.
Ajouter suffisamment de cellules suspendues dans les supports NSC pour ensemencer les plats de culture enduits de membrane du sous-sol. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient 75 à 80% confluent, en s’assurant de changer les médias tous les deux jours. Pour transduire les neurones avec le lentivirus, utilisez un nombre de litres de 340 000 unités transductibles par cellule.
Diluer les unités transductibles dans les médias de culture cellulaire à la concentration nécessaire, et les ajouter aux cellules. Deux jours après l’ajout du lentivirus, lavez les cellules une fois avec un nouveau média qui ne contient pas de bFGF. Continuer à culturer les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans les médias sans bFGF.
Maintenir les cellules pendant environ huit semaines après la transduction, en s’assurant de changer les médias de culture cellulaire tous les deux jours. Utilisez un microscope léger pour visualiser systématiquement les cellules et assurer la viabilité. Après la transduction, retirer les plats de culture de l’incubateur en s’assurant de garder le couvercle sur eux pour garder la culture bien stérile.
Utilisez un microscope fluorescent capable d’imagerie cellulaire vivante pour visualiser les cellules sous un objectif de 10 X avec une excitation de 514 nanomètres et un filtre à émission de 527 nanomètres. Dans cette étude, les neurones transduced avec le lentivirus tau-RDLM-YFP sont étiquetés fluorescentement avec YFP. Les cultures transduced rdlm sont vues pour afficher des agrégats après transduction.
Ces inclusions tachent positif pour le thioflavine. La différenciation neuronale est confirmée par l’immunolabeling du marqueur neuronal bêta-tubulin III dans les cultures. Il est important de se rappeler que les anticorps secondaires étiquetés fluorescents devraient avoir un spectre d’émission d’excitation qui ne chevauche pas celui de YFP.
Bien que les agrégats tau fluorescence jaune seront visibles en l’absence de coloration, thioflavine devrait également être utilisé pour l’imagerie afin de confirmer que le signal fluorescent est agrégé tau et non des débris cellulaires. Après la génération de cellules tau surexprimant, un certain nombre d’évaluations de la santé neuronale et de l’agrégation tau peuvent être effectuées. Par exemple, nous avons constaté que ces cellules présentent une dégénérescence axonale.
En plus des études de culture cellulaire, nous avons utilisé cette méthode pour examiner la pathotérité exosomale dérivée tau.
