In diesem Protokoll beschreiben wir ein In-vitro-Modell der menschlichen Tauopathie. Diese Methode erfüllt einen Materialbedarf, der für Arzneimittelscreenings und Krankheitsmechanismusstudien nützlich sein kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Zellkulturparadigma eine schnellere Bewertung der Tau-Toxizität und potenzieller Tau-Therapeutika im Vergleich zu Tierstudien ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, taut die Kellermembran-Matrixbeschichtung für Kulturplatten bei vier Grad Celsius auf.
Machen Sie ein Milliliter Aliquots und lagern Sie sie bei minus 20 oder minus 70 Grad Celsius. Als nächstes rekonstituieren Sie den grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor in sterilen PBS in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter. Machen Sie 10-Mikroliter-Aliquots und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Dann legen Sie eine neue ungeöffnete 500-Milliliter-Flasche DMEM-F12 mit Glutamin auf. Fügen Sie 10 Milliliter B27, fünf Milliliter N2 und fünf Milliliter Penicillin-Streptomycin hinzu, um neuronale Stammzellmedien vorzubereiten. 50 Milliliter der NSC-Medien in ein konisches Rohr geben und 10 Mikroliter des vorbereiteten bFGF hinzufügen.
Bewahren Sie dieses NSC plus bFGF-Medien bei vier Grad Celsius auf. Entfernen Sie zunächst eine Aliquot von gefrorenen Kellermembran-Matrix-Beschichtung für Zellkulturplatten aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es bei vier Grad Celsius auftauen. Fügen Sie 385 Mikroliter der aufgetauten Kellermembranmatrixbeschichtung zu fünf MilliliterdmEM-F12-Medien hinzu, die Penicillin-Streptomycin enthalten.
Wenn Zellen aus gefrorenen NSC-Beständen aufgetaut werden, nehmen Sie eine Durchstechflasche mit gefrorenen Zellen aus dem Gefrierschrank und erwärmen Sie sie in einem auf 37 Grad Celsius erhitzten Wasserbad, indem Sie die Durchstechflasche im Wasser hin- und herbewegen. Danach die Durchstechflasche mit 70% Ethanol besprühen. Dann übertragen Sie die Zellen unter einer Zellkulturhaube auf ca. 10 Milliliter DMEM-F12-Medien, die Penicillin-Streptomycin enthalten.
Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 1 000 mal g für fünf Minuten. Dann die Medien ansaugen und die Zellen in NSC-Medien wieder aussetzen. Verdünnen Sie die Zellen in NSC-Medien, um die entsprechende Saatdichte für das verwendete Zellkulturgefäß zu erhalten.
Fügen Sie genügend Zellen hinzu, die in NSC-Medien aufgehängt sind, um die mit der Kellermembran matrixbeschichteten Kulturgerichte auszusäen. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, bis sie 75 bis 80% konfluent sind, stellen Sie sicher, dass die Medien jeden zweiten Tag zu ändern. Um Neuronen mit Lentivirus zu transduzieren, verwenden Sie eine Titerzahl von 340. 000 transduzierbaren Einheiten pro Zelle.
Verdünnen Sie die transduzierbaren Einheiten in Zellkulturmedien auf die notwendige Konzentration und fügen Sie sie den Zellen hinzu. Zwei Tage nach dem Hinzufügen des Lentivirus, waschen Sie die Zellen einmal mit frischen Medien, die bFGF nicht enthalten. Die Zellkultivierung bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in Medien ohne bFGF.
Pflegen Sie die Zellen für etwa acht Wochen nach der Transduktion, um sicherzustellen, dass die Zellkultur-Medien jeden zweiten Tag zu ändern. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen routinemäßig zu visualisieren und die Lebensfähigkeit zu gewährleisten. Nach der Transduktion, entfernen Sie die Kulturgerichte aus dem Brutkasten, um sicherzustellen, dass der Deckel auf ihnen zu halten, um die Kultur gut steril zu halten.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, Live-Zell-Bildgebung zu machen, um die Zellen unter einem 10-fachen Objektiv mit einer Anregung von 514 Nanometern und einem Emissionsfilter von 527 Nanometern zu visualisieren. In dieser Studie werden Neuronen, die mit Tau-RDLM-YFP lentivirus transduziert sind, fluoreszierend mit YFP markiert. RDLM-transduced Kulturen werden gesehen, um Aggregate nach der Transduktion anzuzeigen.
Diese Einschlüsse färben positiv für Thioflavin. Die neuronale Differenzierung wird durch Immunlabelierung des neuronspezifischen Markers Beta-Tubulin III in Kulturen bestätigt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper ein Anregungsemissionsspektrum haben sollten, das sich nicht mit dem von YFP überschneidet.
Obwohl gelbe Fluoreszenz-Tau-Aggregate ohne Färbung sichtbar sein werden, sollte Thioflavin auch für die Bildgebung verwendet werden, um zu bestätigen, dass das fluoreszierende Signal tau und nicht zellulärer Schmutz ist. Nach der Generierung von Tau-Überexemittierungszellen kann eine Reihe von Bewertungen der neuronalen Gesundheit und Tau-Aggregation durchgeführt werden. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass diese Zellen axonale Degeneration zeigen.
Zusätzlich zu Zellkulturstudien haben wir diese Methode verwendet, um die Pathogenität exosomal abgeleitete Tau zu untersuchen.
