Neste protocolo detalhamos um modelo in vitro de tauopatia humana. Este método preenche uma necessidade de materiais que podem ser úteis para estudos de rastreamento de medicamentos e mecanismos de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que o paradigma da cultura celular permite uma avaliação mais rápida da toxicidade tau e potenciais terapêuticas tau em comparação com estudos em animais Para iniciar esse procedimento descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas de cultura a quatro graus Celsius.
Faça alíquotas de um mililitro e armazene-as a menos 20 ou menos 70 graus Celsius. Em seguida, reconstituir o fator básico de crescimento do fibroblasto em PBS estéril a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Faça alíquotas de 10 microliter e armazene-as a 4 graus Celsius.
Em seguida, estabeleceu uma nova garrafa de 500 mililitros não abertas de DMEM-F12 com glutamina. Adicione 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, e cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar a mídia neural de células-tronco. Coloque 50 mililitros da mídia NSC em um tubo cônico e adicione 10 microliters do bFGF preparado.
Armazene esta mídia NSC mais bFGF a quatro graus Celsius. Primeiro, remova uma alíquota de revestimento de matriz de membrana de porão congelado para placas de cultura celular do congelador e permite descongelar a quatro graus Celsius. Adicione 385 microliters da matriz de membrana do porão descongelada ao revestimento de cinco mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.
Se as células estiverem sendo descongeladas dos estoques de NSC congelados, pegue um frasco de células congeladas do congelador e aqueça-o em um banho de água aquecido a 37 graus Celsius movendo o frasco para frente e para trás na água. Depois disso, pulverize o frasco com 70% de etanol. Em seguida, sob uma capa de cultura celular, transfira as células para aproximadamente 10 mililitros de mídia DMEM-F12 contendo penicilina-estreptomicina.
Centrífuga à temperatura ambiente a 1.000 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire a mídia e resuspende as células em mídia NSC. Diluir as células em mídia NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para o vaso de cultura celular que está sendo usado.
Adicione células suficientes suspensas na mídia NSC para semear os pratos de cultura revestidos da matriz de membrana do porão. Cresça as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que elas sejam 75 a 80% confluentes, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias. Para transduturar neurônios com lentivírus, use uma contagem de 340.000 unidades transdutíveis por célula.
Diluir as unidades transdutíveis nos meios de cultura celular à concentração necessária, e adicioná-las às células. Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células uma vez com mídia fresca que não contenha bFGF. Continue a culminar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono na mídia sem bFGF.
Mantenha as células por cerca de oito semanas após a transdução, certificando-se de mudar a mídia de cultura celular a cada dois dias. Use um microscópio leve para visualizar rotineiramente as células e garantir a viabilidade. Após a transdução, remova os pratos de cultura da incubadora certificando-se de manter a tampa sobre eles para manter a cultura bem estéril.
Use um microscópio fluorescente capaz de imagens de células vivas para visualizar as células sob um objetivo de 10X com uma excitação de 514 nanômetros e um filtro de emissão de 527 nanômetros. Neste estudo, os neurônios transduzidos com lentivírus tau-RDLM-YFP são fluorescentemente marcados com YFP. Culturas transduzidas pelo RDLM são vistas para exibir agregados após a transdução.
Essas inclusões mancham positivo para thioflavina. A diferenciação neuronal é confirmada pela imunolabelação do marcador beta-tubulin III específico do neurônio nas culturas. É importante lembrar que anticorpos secundários com marca fluorescente devem ter um espectro de emissão de excitação que não se sobreponha ao de YFP.
Embora os agregados tau de fluorescência amarela sejam visíveis na ausência de coloração, a tiapenina também deve ser usada para imagens, a fim de confirmar que o sinal fluorescente é agregado tau e não detritos celulares. Após a geração de células tau superexpressivas, uma série de avaliações de saúde neuronal e agregação tau podem ser realizadas. Por exemplo, descobrimos que essas células apresentam degeneração axonal.
Além dos estudos de cultura celular, usamos este método para examinar a patogenicidade exosóica derivada tau.
