이 프로토콜에서 우리는 인간 타우오병증의 체외 모델을 자세히 설명합니다. 이 방법은 약물 선별 및 질병 메커니즘 연구에 유용 할 수있는 물질 필요를 채웁니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 배양 패러다임이 동물 연구에 비해 타우 독성 및 잠재적 타우 치료에 대한 보다 신속한 평가를 허용한다는 것입니다.이 절차는 4섭씨에서 배양 판에 대한 지하 막 매트릭스 코팅을 해동하기 시작한다.
1 밀리리터 알리쿼트를 만들고 영하 20도 또는 영하 70도에 보관하십시오. 다음으로, 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 멸균 PBS의 기본 섬유아세포 성장 인자를 재구성한다. 10 마이크로 리터 알리쿼트를 만들고 섭씨 4도에 보관하십시오.
그런 다음 글루타민을 곁들인 DMEM-F12의 새로운 미개봉 500 밀리리터 병을 설정합니다. B27의 밀리리터 10개, N2 5밀리리터, 페니실린 연쇄상 구균 5밀리리터를 추가하여 신경 줄기 세포 매체를 준비합니다. NSC 미디어의 50 밀리리터를 원내 튜브에 넣고 준비된 bFGF의 마이크로리터 10기를 추가합니다.
이 NSC 플러스 bFGF 미디어를 섭씨 4도에 저장합니다. 첫째, 냉동고에서 세포 배양 판을 위한 냉동 지하 막 매트릭스 코팅의 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에서 해동할 수 있게 한다. 페니실린-연쇄상 구균을 함유한 DMEM-F12 매체의 5밀리리터에 해동된 지하 막 매트릭스 코팅의 385마이크로리터를 추가합니다.
동결된 NSC 주식에서 세포가 해동되는 경우 냉동고에서 냉동 셀 바이알을 가져 와서 물 에서 유리병을 앞뒤로 이동하여 섭씨 37도까지 가열된 수조에서 따뜻하게 하십시오. 그 후, 바이알을 70%에탄올로 스프레이합니다. 그런 다음 세포 배양 후드 하에서 페니실린-연쇄절제술을 함유한 DMEM-F12 배지의 약 10밀리리터로 세포를 이송한다.
실온에서 원심분리기는 5분 동안 1, 000배 g입니다. 그런 다음 미디어를 흡인하고 NSC 미디어의 세포를 다시 중단합니다. 사용 중인 세포 배양 용기에 적합한 파종 밀도를 얻기 위해 NSC 매체에서 세포를 희석한다.
NSC 배지에 매달린 충분한 세포를 추가하여 지하 막 매트릭스 코팅 배양 접시를 시드합니다. 75~80%의 컨실수될 때까지 이산화탄소가 5%인 섭씨 37도에서 세포를 성장시켜 매일 미디어를 변경합니다. 렌즈 바이러스와 뉴런을 변환하려면, 세포 당 340, 000 변환 단위의 티터 수를 사용합니다.
세포 배양 매체의 변환 가능한 단위를 필요한 농도로 희석하고 세포에 추가합니다. 렌티 바이러스를 추가 한 후 이틀, bFGF를 포함하지 않는 신선한 매체로 한 번 세포를 씻어. bFGF없이 미디어에서 5 %의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 계속 배양하십시오.
세포 배양 매체를 격일로 변경하려면 트랜스포션 후 약 8주 동안 세포를 유지한다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 일상적으로 시각화하고 생존가능성을 보장합니다. 트랜스포메이션 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하여 배양소가 멸균되도록 뚜껑을 유지하십시오.
514 나노미터의 여기와 527 나노미터의 방출 필터로 10X 목표하에서 세포를 시각화하기 위해 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경을 사용합니다. 이 연구에서 타우 RDLM-YFP 렌티바이러스로 변형된 뉴런은 YFP로 형광태그가 매답합니다. RDLM 변환 배양은 변환 후 집계를 표시하는 것으로 보입니다.
이러한 포함 은 티오 플라빈에 대한 긍정적 인 얼룩. 뉴런 분화는 배양에서 뉴런 특이적 마커 베타-튜불린 III의 면역 라벨링에 의해 확인된다. 형광 태그이차이차 항체는 YFP의 것과 겹치지 않는 흥분 방출 스펙트럼을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
황색 형광 타우 응집체는 염색이 없는 상태에서 볼 수 있지만, 티오플라빈은 형광 신호가 세포 이물질이 아닌 타우를 집계하는지 확인하기 위해 이미징에도 사용되어야 한다. 타우 과잉 발현 세포의 생성에 이어, 신경 건강과 타우 응집의 평가의 숫자는 수행 될 수있다. 예를 들어, 우리는 이 세포가 축축변성을 표시한다는 것을 것을을 발견했습니다.
세포 배양 연구 외에도, 우리는 병원성 엑소소말 유래 타우를 검사하기 위해이 방법을 사용했다.
