このプロトコルでは、ヒトタウオパチーのインビトロモデルを詳述する。この方法は、薬物スクリーニングおよび疾患メカニズム研究に有用であり得る材料の必要性を満たす。この技術の主な利点は、細胞培養パラダイムが動物研究と比較してタウ毒性および潜在的タウ治療薬のより迅速な評価を可能にすることであるこの手順を開始するには、培養プレートの基基膜マトリックスコーティングを摂氏4度で解凍する。
1ミリリットルのアリコートを作り、マイナス20度またはマイナス70度で保存します。次に、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で滅菌PBS中の塩基性線維芽細胞増殖因子を再構成する。10マイクロリットルのアリコートを作り、摂氏4度で保管してください。
その後、グルタミンとDMEM-F12の新しい未開封の500ミリリットルのボトルを設定します。B27の10ミリリットル、N2の5ミリリットル、および5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシンを加えて、神経幹細胞培地を調製する。50ミリリットルのNSC培地を円錐チューブに入れ、調製したbFGFの10マイクロリットルを加えます。
このNSCプラスbFGFメディアを摂氏4度で保管してください。まず、冷凍庫から細胞培養プレート用の凍結基質膜マトリックスコーティングのアリコートを取り除き、摂氏4度で解凍できるようにします。ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の5ミリリットルに解凍された基質膜マトリックスコーティングの385マイクロリットルを追加します。
細胞が凍結したNSCストックから解凍されている場合は、冷凍庫から冷凍細胞のバイアルを取り出し、バイアルを水中で前後に動かして摂氏37度に加熱した水浴で温めます。この後、バイアルに70%エタノールを吹き付けます。次いで細胞培養フードの下で、ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地の約10ミリリットルに細胞を移す。
室温で5分間1,000倍gの遠心分離機。その後、メディアを吸引し、NSCメディアの細胞を再中断します。NSC培地で細胞を希釈して、使用されている細胞培養容器に適した播種密度を得る。
NSC培地に懸濁された十分な細胞を加えて、基質膜マトリックスコーティングされた培養皿を播種する。彼らは75〜80%コンフルエントになるまで5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞を成長させ、一日おきにメディアを変更してください。レンチウイルスでニューロンをトランスデュースするには、細胞あたり340,000のトランスデューティユニットのタンターカウントを使用してください。
細胞培養培地中の導入単位を必要な濃度まで希釈し、細胞に加えます。レンチウイルスを添加した2日後、bFGFを含まない新鮮な培地で細胞を1回洗浄する。bFGFを使用しない培地で5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を培養し続けます。
細胞を転移後約8週間維持し、細胞培養培地を1日おきに変更するようにしてください。細胞を日常的に可視化し、生存率を確保するために、軽い顕微鏡を使用してください。トランスダクション後、培養物をよく無菌に保つために蓋を保つように培養器から培養皿を取り除きます。
514ナノメートルの励起と527ナノメートルの放出フィルターで10Xの目的の下で細胞を視覚化するために生細胞のイメージ投射が可能な蛍光顕微鏡を使用しなさい。本研究では、タウ-RDLM-YFPレンチウイルスを導入したニューロンがYFPで蛍光的にタグ付けされている。RDLM導入培養物は、伝達後の凝集体を表示することが分かる。
これらのインクルージョンはチオフラビンに陽性染色する。神経細胞分化は、培養中のニューロン特異的マーカーβ-チューブリンIIIの免疫標識によって確認される。蛍光タグ付き二次抗体は、YFPと重ならない励起発光スペクトルを持つ必要があることを覚えておくことが重要です。
黄色の蛍光タウ凝集体は染色がない場合には見えますが、蛍光シグナルが細胞の破片ではなく凝集タウであることを確認するために、イメージングにも使用する必要があります。タウ過剰発現細胞の生成後、多くの神経細胞の健康およびタウ凝集の評価が行われる。例えば、これらの細胞は軸索変性を示すことがわかりました。
細胞培養研究に加えて、この方法を用い、病原性外生タウを調べた。
