该协议可用于生成非随机小鼠模型，用于测试和量化活鼠大脑中不活跃的 X 链接 Mecp2 染色体的重新激活。此模型可以很容易地修改，以研究其他 X 相关疾病模型（如 DDX3X 综合征）中的 Xi 重新激活。我是桑奇塔·巴特纳加尔实验室的博士后，我将和郑泽民一起演示手术过程。
首先将麻醉鼠标定位在立体定向平台中，将切口钩在鼻子抑制器的咬杆上。拧紧鼻夹，同时保持鼠标头在水平平面上。调整耳杆的高度以到达耳道的耳道部分，以保持头部固定。
然后用局部防腐剂和70%乙醇的交替擦拭对头部进行消毒。当鼠标准备好时，使用无菌手术刀在头皮中间做一个0.75厘米的水平切口。使用 0.45 毫米毛刺在右和左皮质半球上方钻两个对称孔，从下垂缝合线钻两毫米，在左骨的近似中间钻两毫米的羊皮缝合线。
将 10 微升注射器牢固地连接到立体定向平台，将 10 微升新准备的化学抑制剂加载到注射器中。将针头推进到第一个毛刺孔中，同时保持针头垂直于头骨。当针穿过头骨时，将立体定向数字显示屏上的坐标归零，并推进针头的尖端，直到其深度达到 2.5 毫米。
将针头提取0.5毫米至两毫米的深度，并在一分钟内缓慢注入溶液的整个10微升体积。所有抑制剂都送来后，将针头留在大脑中再留一分钟，然后取走针头。仅使用车辆作为控制装置将注射到第二个毛刺孔中，并关闭切口上的皮肤。
然后将鼠标从立体声装置转移到 37 摄氏度的加热垫上，并进行监控，直到完全恢复。在剂量方案结束时，将鼠标固定到解剖垫上。使用剪刀和钳子，通过肋骨下方的切口和腹壁进行横向切口。
小心地将肝脏与隔膜分离，沿着肋骨的整个长度切开隔膜，露出胸腔。使用剪刀将切口切到左心室的后端，并在两分钟内立即用大约 15 毫升 PBS 注射右心室。成功的灌注将导致肝脏颜色从红色变成淡粉色。
当所有 PBS 已交付后，在两分钟内用 PBS 中约 10 毫升的 4% 甲状甲醛来给心脏。收获头部后，用剪刀在头皮上做中线切口，露出头骨。将剪刀尖放入前脑大体中，以方便在头骨中向眼睛创建横向切口。
在头骨的另一侧进行类似的切口，使剪刀的端尽可能肤浅，并切割头骨在眼睛之间和鼠标鼻子上方的区域。使用钳子轻轻地剥下脑半球的颅骨，用铲子抬高大脑。仔细解剖将大脑固定到头骨并放入塑料盘中的颅神经纤维。
然后切除小脑和嗅觉球。为了获得脑组织的部分，首先在PBS中充满4%半成甲醛的15毫升管中固定大脑，在4摄氏度过夜。第二天早上，每次洗涤新鲜 PBS，至少冲洗脑组织三次，5分钟，温度为4摄氏度。
最后一次洗涤后，用剪刀和钳子拆下每个半球的前部，将样品放入标有低温模具的正面向下。将每个组织淹没在最佳切割温度介质中，然后将样品在 10 毫米塑料 Petri 盘中冷冻，以存放零下 80 摄氏度。要确定Xi的重新活化，将5至6微米的脑组织部分浸入抗原检索溶液中，在100摄氏度的热块上浸泡5分钟。
在孵化结束时，在室温下用四个五分钟洗涤，每次洗涤新鲜 PBS，然后将幻灯片浸入阻尼溶液中。在室温下20分钟后，每次洗涤用新鲜洗涤缓冲液洗三次幻灯片，5分钟。在四摄氏度下将组织样本与适当的原抗体在四摄氏度下染色过夜。
在荧光显微镜上拍摄幻灯片，调整对比度和亮度，以便量化药物和车辆治疗小鼠脑半球的 GFP 阳性细胞数量。为了证明非随机X染色体灭活小鼠模型对于非活动X染色体再活化研究的可行性，通过基因分型PCR和流细胞切除术确认了雌性转基因小鼠胚胎成纤维细胞的基因型。经PCR评估，GFP标记甲基氯联苯基蛋白的表达两个基因或 MECP2 被药物重新激活，而不是车辆处理。
非随机X染色体灭活小鼠模型胚胎成纤维细胞也表示核GP后药物，但没有车辆治疗证明X染色体灭活因子抑制剂重新激活灭活X染色体链接MCP2在小鼠胚胎成纤维细胞。药物治疗在药物注入的大脑半球中大约30%的细胞中重新激活灭活X染色体 MECP2-GFP，而在车辆注入半球中未检测到重新激活。微管相关蛋白两个阳性神经元在药物治疗半球中也出现GP阳性，表明有灭活X染色体MCP2-GFP表达。
药物方案将取决于小分子抑制剂的目标和疗效，因此在体内测试之前优化体外剂量和治疗。非随机小鼠模型可用于单独或组合测试不同的药物。事实上，我们和其他人已经发现了几种可药物的X染色体失活因子。
