このプロトコルは、生きているマウスの脳内の非アクティブなXリンクMecp2染色体の再活性化をテストし、定量するための非ランダムマウスモデルを生成するために使用することができる。このモデルは、DDX3X症候群などの他のX結合疾患モデルにおけるXi再活性化を研究するために容易に変更することができる。私はサンチータ・バトナガルの研究室のポストドクターで、ゼミング・ジェンと一緒に手順をデモンストレーションします。
まず、麻酔付きマウスを立体的なプラットフォームに配置し、切開器をスナッテの一口バーに引っ掛けます。マウスの頭部をレベル平面に保ちながら、鼻クランプを締めます。耳を固定して保つために外耳道の尾部に到達するために耳棒の高さを調整します。
その後、局所防腐剤と70%エタノールの交互ワイプで頭部を消毒します。マウスの準備ができたら、無菌メスを使用して、メス中に0.75センチメートルの水平切開を行います。0.45ミリメートルのバリを使用して、矢状縫合糸と頭頂骨のおよそ中央にあるラムドイド縫合糸から2ミリメートルの左右の皮質半球の上に2つの対称的な穴を掘削します。
10マイクロリットルのシリンジを立体的プラットフォームにしっかりと取り付け、10マイクロリットルの新しい化学インヒビターをシリンジにロードします。針を頭蓋骨に垂直に保ちながら、針を最初のバリ穴に進めます。針が頭蓋骨を横断するとき、定位デジタルディスプレイ上の座標をゼロにし、2.5ミリメートルの深さに達するまで針の先端を進めます。
針0.5ミリメートルを2ミリメートルの深さまで引き出し、1分間にわたって溶液の10マイクロリットルの体積全体をゆっくりと注入します。すべての阻害剤が送達された後、針を引き出す前に、さらに1分間脳内に針を残します。制御としてのみ車両を使用して第2バリ穴への注入を繰り返し、切開部の皮膚を閉じます。
次に、マウスを立体性装置から37°Cの加熱パッドに移し、完全に回復するまでモニタリングします。用量レジメンの終わりに、マウスを解剖パッドに固定する。はさみと鉗子を使用して、胸部のすぐ下の内壁と腹壁を通して横切りを行います。
慎重に横隔膜から肝臓を分離し、胸膜腔を露出させるために胸部の全長に沿って横隔膜を切断します。はさみを使用して左心室の後部端に切開し、すぐに2分間にわたって約15ミリリットルのPBSで右心室を注入します。正常な灌流は、肝臓の色が赤から淡いピンクに変化します。
すべてのPBSが配信されたら、2分間にわたってPBSで約10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで心臓を浸透させます。頭を収穫した後、頭皮に中線切開を行い、頭蓋骨を露出させるためにはさみを使用します。目に向かって頭蓋骨の横切開の作成を容易にするために、角筋マグナムにハサミの1つの先端を置きます。
頭蓋骨の反対側に同様の切開を行い、はさみの端を可能な限り表面的に保ち、目とマウスの鼻の上の頭蓋骨の領域を切断します。鉗子を使用して脳半球から頭蓋骨を優しく剥がし、へらを使って脳を高めます。頭蓋神経線維を慎重に解剖し、頭蓋を頭蓋骨に固定し、脳をプラスチック皿に入れます。
その後、小脳と嗅球を切除します。脳組織の切片を得るために、最初に一晩摂氏4度でPBSで4%パラホルムアルデヒドで満たされた15ミリリットルのチューブで脳を固定する。翌朝、脳組織を洗浄ごとに新鮮なPBSで摂氏4度で少なくとも3回5分間リンスする。
最後の洗浄後、各半球の前部をはさみと鉗子で取り出し、サンプルをラベル付きのクライオモールドの前面に下に置きます。10ミリメートルのプラスチックペトリ皿でサンプルを液体窒素で凍結し、マイナス80°Cの貯蔵を行う前に、最適な切断温度媒体に各組織を沈めます。Xi再活性化を決定するには、5〜6マイクロメートルの脳組織切片を100°Cの熱ブロックに5分間抗原検索溶液に浸す。
インキュベーションの最後に、スライドをブロッキング溶液に浸す前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで室温で4回の5分間の洗浄でスライドを洗います。室温で20分後、スライドを洗浄ごとに新鮮な洗浄バッファーで5分間3回洗浄します。一晩摂氏4度で適切な一次抗体で組織サンプルを染色する。
コントラストと明るさを調整して、マウス脳半球を治療した薬物および車両の両方に対するGFP陽性細胞の数を定量化できるように、蛍光顕微鏡上のスライドを画像化します。非非活性X染色体再活性化研究のための非ランダムX染色体不活性化マウスモデルの実現可能性を実証するために、雌のトランスジェニックマウス胚性線維芽細胞の遺伝子型を、遺伝子型PCRおよびフローサイトメトリーによって確認した。PCRによって評価されるように、GFPタグ付きメチレンCPG結合タンパク質2遺伝子またはMECP2の発現は、薬物によって再活性化されたが、車両治療では再活性化されなかった。
非ランダムX染色体不活性化マウスモデル胚性線維芽細胞はまた、薬物後に核GFPを発現したが、マウス胚性線維芽細胞における不活性化X染色体結合MECP2を再活性化するX染色体不活性化因子阻害剤を示す車両治療は発現しなかった。薬物治療は、脳半球を注入した薬物中の細胞の約30%で不活性化X染色体MECP2-GFPを再活性化する一方、車両注入半球では再活性化は検出されない。微小管関連タンパク質2つの陽性ニューロンは、不活性化X染色体MECP2-GFP発現を示す薬物処理半球においてもGFP陽性である。
薬物レジメンは、インビボでの試験前にインビトロで用量と治療を最適化するように、低分子阻害剤の標的と有効性に依存する。非ランダムマウスモデルは、個別に、または組み合わせて異なる薬物をテストするために利用することができる。実際、我々および他の人々はいくつかの薬剤可能なX染色体不活性化因子を同定した。
