Bu protokol, canlı bir farenin beynindeki aktif olmayan X'e bağlı Mecp2 kromozomunun yeniden aktivasyonunu test etmek ve ölçmek için rastgele olmayan bir fare modeli oluşturmak için kullanılabilir. Bu model kolayca DDX3X sendromu gibi diğer X-bağlantılı hastalık modellerinde Xi reaktivasyon çalışma için değiştirilebilir. Ben Sanchita Bhatnagar laboratuvarında bir post doc ve Ben Zeming Zheng ile prosedür gösteren olacak.
Anestezili fareyi, beyin koruyucunun ısırık çubuğuna bağlanmış kesicilerle stereotaktik bir platformda konumlandırarak başlayın. Farenin kafasını düz bir düzlemde tutarken burun kıskacını sıkın. Kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayarak kulak kanalının kaudal kısmına ulaşarak başı hareketsiz tutun.
Sonra bir topikal antiseptik ve% 70 etanol alternatif mendilleri ile baş dezenfekte. Fare hazır olduğunda, orta kafa derisi 0.75 santimetre yatay kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Sağ ve sol kortikal hemisferlerin iki milimetre üzerinde sagittal sütür ve parietal kemiğin yaklaşık ortasında lambdoid sütür iki milimetre üzerinde iki simetrik delik açmak için 0,45 milimetrelik bir çapak kullanın.
Stereotaktik platforma 10 mikrolitrelik bir şırınga takın ve 10 mikrolitre taze hazırlanmış kimyasal inhibitörü şırınganın içine yükleyin. İğneyi kafatasına dik tutarken iğneyi ilk çapak deliğine doğru ilerletin. İğne kafatasından geçtiğinde, stereotaktik dijital ekrandaki koordinatları sıfırlayın ve 2,5 milimetre derinliğe ulaşana kadar iğnenin ucunu ilerletin.
İğneyi 0,5 milimetreden iki milimetre derinliğe çekin ve çözeltinin 10 mikrolitrelik hacminin tamamını bir dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Tüm inhibitör teslim edildikten sonra, iğneçekmeden önce bir dakika daha beyne iğne bırakın. Sadece bir kontrol olarak araç kullanarak ikinci çapak deliğe enjeksiyon tekrarlayın ve kesi üzerinde cilt kapatın.
Daha sonra fareyi stereotaktik cihazdan tam iyileşmeye kadar izleyerek 37 derece lik bir ısıtma yastığına aktarın. Doz rejiminin sonunda, fareyi bir diseksiyon pedi üzerinde sabitleyin. Göğüs kafesinin hemen altındaki integument ve karın duvarından lateral bir kesi yapmak için makas ve forceps kullanın.
Dikkatle diyafram karaciğer ayırmak ve plevral kavite ortaya çıkarmak için göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca diyafram ile kesti. Sol ventrikül arka ucunda bir kesi yapmak için makas kullanın ve hemen iki dakikalık bir süre içinde PBS yaklaşık 15 mililitre ile sağ kalp odası enjekte. Başarılı bir perfüzyon soluk pembe kırmızı bir karaciğer renk değişikliği neden olacaktır.
Tüm PBS teslim edildiğinde, iki dakika içinde PBS%4 paraformaldehit yaklaşık 10 mililitre ile kalp perfuse. Baş hasat sonra, kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi bir orta hat kesi yapmak için makas kullanın. Göze doğru kafatasında yanal bir kesi oluşumunu kolaylaştırmak için foramen magnum içine makas bir ucunu yerleştirin.
Kafatasının diğer tarafında mümkün olduğunca yüzeysel olarak makas ucunu tutarak benzer bir kesi yapmak ve göz ve farenin burun üzerinde kafatası nın bölge kesti. Nazikçe beyin hemisferinden kafatası kemikleri soymak ve beyin yükseltmek için bir spatula kullanmak için forceps kullanın. Dikkatle kafatası için beyin düzeltmek ve plastik bir çanak içine beyin yerleştirin kranial sinir lifleri incelemek.
Sonra beyincik ve koku ampulleri çıkarmak. Beyin dokusunun bölümlerini elde etmek için, ilk bir gecede dört derece santigrat pbs% 4 paraformaldehit dolu bir 15 mililitretüp beyin düzeltmek. Ertesi sabah, beyin dokusunu en az üç kez beş dakika boyunca dört santigrat derecede yıkayın başına taze PBS'de durulayın.
Son yıkamadan sonra, makas ve forceps ile her yarımkürenin ön kaldırın ve aşağı etiketli kriyo-kalıplar içine örnekleri yerleştirin. Eksi 80 santigrat depolama için 10 milimetrelik plastik Petri kabında sıvı nitrojen numuneleri dondurma önce optimum kesme sıcaklığı orta her doku batırın. Xi reaktivasyon belirlemek için, 100 derece santigrat ısı bloğu beş dakika boyunca antijen alma çözeltisi beş ila altı mikrometre beyin dokusu bölümleri batırın.
Kuluçka sonunda, slaytları bloklama çözeltisi içine batırmadan önce oda sıcaklığında dört beş dakikalık yıkama ile yıkama başına taze PBS ile yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika sonra, yıkama başına taze yıkama tampon beş dakika slaytlar üç kez yıkayın. Doku örneklerini bir gecede uygun primer antikorlarla dört dereceye kadar lekeleyin.
Kontrast ve parlaklığı ayarlayarak hem ilaç hem de araç la tedavi edilen fare beyin yarıküreleri için GFP pozitif hücrelerinin sayısının ölçülmesine olanak sağlayacak bir floresan mikroskop üzerindeki slaytları görüntüleyin. İnaktif X kromozomu reaktivasyonu çalışmaları için rastgele olmayan X kromozomu inaktivasyon fare modelinin fizibilitesini göstermek için, kadın transgenik fare embriyonik fibroblastın genotipleri pcr ve akış sitometrisi ile doğrulandı. PCR tarafından değerlendirildiği gibi, GFP etiketli metilen CPG bağlayıcı protein iki gen veya MECP2 ifadesi ilaç ile yeniden aktive edildi, ancak araç tedavisi değil.
Rastgele olmayan X kromozomu inaktivasyon fare modeli embriyonik fibroblastlar da ilaç sonra nükleer GFP ifade ama x kromozominin inaktivasyon faktörü inhibitörleri gösteren araç tedavi fare embriyonik fibroblastlarda inaktive X kromozomu bağlantılı MECP2 reaktive. İlaç tedavisi, ilaç infüzyonlu beyin yarımküredeki hücrelerin yaklaşık %30'unda inaktive X kromozomu MECP2-GFP'yi yeniden etkinleştirirken, araç aşılı hemisferlerde reaktivasyon saptanır. Mikrotübül ilişkili protein iki pozitif nöron da inaktive X kromozomu MECP2-GFP ekspresyonunun göstergesi olarak ilaç tedavi edilen hemisferlerde GFP pozitiftir.
İlaç rejimi hedef ve küçük molekül inhibitörleri etkinliğine bağlı olacak böylece in vivo test etmeden önce doz ve tedavi in vitro optimize. Rastgele olmayan fare modeli, farklı ilaçları tek tek veya birlikte test etmek için kullanılabilir. Aslında, biz ve diğerleri birkaç druggable X kromozomu inaktivasyon faktörleri tespit ettik.
