Ce protocole peut être utilisé pour générer un modèle de souris non aléatoire pour tester et quantifier la réactivation du chromosome Mecp2 inactif lié à X dans le cerveau d’une souris vivante. Ce modèle peut être facilement modifié pour étudier la réactivation de Xi dans d’autres modèles de maladie X-liés tels que le syndrome de DDX3X. Je suis post-doc dans le laboratoire de Sanchita Bhatnagar et je vais démontrer la procédure avec Zeming Zheng.
Commencez par positionner la souris anesthésiée dans une plate-forme stéréotaxique avec les incisives accrochées dans la barre de morsure du restrainer museau. Serrez la pince avant tout en gardant la tête de la souris sur un plan de niveau. Ajustez la hauteur des barreaux d’oreille pour atteindre la partie caudale du conduit auditif pour maintenir la tête immobilisée.
Désinfectez ensuite la tête avec des lingettes alternées d’un antiseptique topique et de 70% d’éthanol. Lorsque la souris est prête, utilisez un scalpel stérile pour faire une incision horizontale de 0,75 centimètre dans le cuir chevelu moyen. Utilisez une bavure de 0,45 millimètre pour percer deux trous symétriques au-dessus des hémisphères corticals droit et gauche à deux millimètres de la suture sagittale et de la suture lambdoid au milieu approximatif de l’os pariétal.
Fixez fermement une seringue de 10 microlitres à la plate-forme stéréotaxique et chargez 10 microlitres d’inhibiteur chimique fraîchement préparé dans la seringue. Avancez l’aiguille dans le premier trou de bavure tout en gardant l’aiguille perpendiculaire au crâne. Lorsque l’aiguille traverse le crâne, zéro sur les coordonnées sur l’écran numérique stéréotaxique et avancer le bout de l’aiguille jusqu’à ce qu’il atteigne une profondeur de 2,5 millimètres.
Retirer l’aiguille de 0,5 millimètre à une profondeur de deux millimètres et injecter lentement l’ensemble du volume de 10 microlitres de la solution sur une période d’une minute. Après que tout l’inhibiteur a été livré, laissez l’aiguille dans le cerveau pendant une autre minute avant de retirer l’aiguille. Répétez l’injection dans le deuxième trou de bavure en utilisant le véhicule uniquement comme un contrôle et fermez la peau sur l’incision.
Ensuite, transférez la souris de l’appareil stéréotaxique sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius avec surveillance jusqu’à la récupération complète. À la fin du régime de dose, fixez la souris sur un tampon disséquant. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision latérale à travers l’intégument et la paroi abdominale juste sous la cage thoracique.
Séparez soigneusement le foie du diaphragme et coupez le diaphragme sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. Utilisez les ciseaux pour faire une incision à l’extrémité postérieure du ventricule gauche et injectez immédiatement la chambre du cœur droit avec environ 15 millilitres de PBS sur une période de deux minutes. Une perfusion réussie entraînera un changement de couleur du foie du rouge au rose pâle.
Lorsque tout le PBS a été livré, parcourir le cœur avec environ 10 millilitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS plus de deux minutes. Après la récolte de la tête, utiliser des ciseaux pour faire une incision midline dans le cuir chevelu pour exposer le crâne. Placez une pointe des ciseaux dans le magnum foramen pour faciliter la création d’une incision latérale dans le crâne vers l’œil.
Faire une incision similaire de l’autre côté du crâne en gardant l’extrémité des ciseaux aussi superficielle que possible et couper la région du crâne entre les yeux et au-dessus du nez de la souris. Utilisez des forceps pour peler doucement les os crâniens des hémisphères cérébraux et utilisez une spatule pour élever le cerveau. Disséquer soigneusement les fibres nerveuses crâniens qui fixent le cerveau au crâne et placent le cerveau dans un plat en plastique.
Excisez ensuite le cervelet et les bulbes olfactifs. Pour obtenir des sections du tissu cérébral, d’abord fixer le cerveau dans un tube de 15 millilitres rempli de 4% paraformaldéhyde dans PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, rincer le tissu cérébral au moins trois fois pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius en PBS frais par lavage.
Après le dernier lavage, retirer l’avant de chaque hémisphère avec des ciseaux et des forceps et placer les échantillons dans des cryo-moules étiquetés côté avant vers le bas. Submergez chaque tissu dans un milieu de température de coupe optimal avant de casser le gel des échantillons dans de l’azote liquide dans une boîte de Pétri en plastique de 10 millimètres pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer la réactivation de Xi, immerger cinq à six sections de tissu cérébral de micromètre dans la solution de récupération d’antigène pendant cinq minutes sur un bloc de chaleur de 100 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les toboggans avec quatre lavages de cinq minutes à température ambiante avec du PBS frais par lavage avant d’immerger les glissières dans la solution de blocage. Après 20 minutes à température ambiante, laver les glissières trois fois pendant cinq minutes dans un tampon de lavage frais par lavage. Tacher les échantillons de tissus avec les anticorps primaires appropriés à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Imagez les diapositives sur un microscope de fluorescence ajustant le contraste et la luminosité pour permettre la quantification du nombre de cellules positives de GFP pour les hémisphères cérébraux de souris traités par drogue et par véhicule. Pour démontrer la faisabilité du modèle non aléatoire de souris d’inactivation de chromosome X pour des études inactives de réactivation de chromosome de X, les génotypes du fibroblast embryonnaire transgénique femelle de souris ont été confirmés par PCR génotypage et cytométrie de flux. Tel qu’évalué par PCR, l’expression du GFP marqué méthylène CPG liant la protéine deux gène ou MECP2 a été réactivée par le traitement de drogue mais pas de véhicule.
Les fibroblastes embryonnaires non aléatoires de souris d’inactivation de chromosome de X ont également exprimé le GFP nucléaire après le traitement de drogue mais pas de véhicule démontrant les inhibiteurs de facteur d’inactivation de chromosome X réactivent le chromosome X inactivé lié MECP2 dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Le traitement médicamenteux réactive le chromosome X INactivé MECP2-GFP dans environ 30% des cellules des hémisphères cérébraux infusés de médicaments alors qu’aucune réactivation n’est détectée dans les hémisphères infusés par les véhicules. Protéine microtubule-associée deux neurones positifs sont également GFP positif dans les hémisphères traités par drogue indicatif de l’expression inactivée de chromosome X MECP2-GFP.
Le régime médicamenteux dépendra de la cible et de l’efficacité des inhibiteurs des petites molécules afin d’optimiser la dose et le traitement in vitro avant de tester in vivo. Le modèle de souris non aléatoire peut être utilisé pour tester différents médicaments individuellement ou en combinaison. En fait, nous et d’autres avons identifié plusieurs facteurs d’inactivation du chromosome X pharmacables.
