이 프로토콜은 살아있는 마우스의 뇌에서 비활성 X 연결 Mecp2 염색체의 재활성화를 테스트하고 정량화하기 위한 비무작위 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이 모델은 DDX3X 증후군과 같은 다른 X 연결 질병 모델에서 Xi 재활성화를 연구하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 나는 산치타 바트나가르의 실험실에서 게시물 문서이고 나는 Zeming Zheng와 절차를 시연 할 것입니다.
주미 제지의 바이트 바에 매여 선명절과 스테레오전술 플랫폼에 마취 마우스를 배치하여 시작합니다. 마우스의 머리를 레벨 평면에 유지하면서 코 클램프를 조입니다. 이어바의 높이를 조정하여 외이도의 소들 부분에 도달하여 머리를 고정 상태로 유지합니다.
그런 다음 국소 살균 및 70 %에탄올의 번갈아 닦아 머리를 소독합니다. 마우스가 준비되면 멸균 메스를 사용하여 중간 두피에 0.75센티미터의 수평 절개를 합니다. 0.45 밀리미터 버를 사용하여 좌측 피질 반구 의 두 개의 대칭 구멍을 주교하여 처진 봉합사에서 2밀리미터, 정수리 뼈의 대략적인 중간에 있는 람도이드 봉합사를 드릴수 있습니다.
10 마이크로리터 주사기를 스테레오테전술 플랫폼에 단단히 부착하고 새로 준비된 화학 억제제 10마이크로리터를 주사기에 적재합니다. 바늘을 두개골에 수직으로 유지하면서 첫 번째 버 구멍으로 바늘을 전진시. 바늘이 두개골을 통과할 때, 스테레오전술 디지털 디스플레이의 좌표를 제로아웃하고 2.5밀리미터깊이에 도달할 때까지 바늘 끝을 전진시다.
바늘을 0.5 밀리미터에서 2밀리미터 깊이로 인출하고 1분 동안 용액의 전체 10 마이크로리터 부피를 천천히 주입한다. 모든 억제제가 전달된 후 바늘을 철회하기 전에 뇌에 바늘을 1분 더 남겨 둡니다. 차량을 제어로 사용하여 두 번째 버 구멍에 주입을 반복하고 절개 시 피부를 닫습니다.
그런 다음 전체 복구까지 모니터링과 37섭씨 가열 패드에 스테레오전술 장치에서 마우스를 전송합니다. 투여량 식이요법의 끝에서, 해부 패드에 마우스를 고정. 가위와 집게를 사용하여 흉곽 바로 아래 의 정립과 복벽을 통해 측면 절개를합니다.
간을 다이어프램에서 조심스럽게 분리하고 흉막의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출시합니다. 가위를 사용하여 왼쪽 심실의 후부 끝에 절개를 하고 즉시 2 분 동안 PBS의 약 15 밀리리터로 오른쪽 심장 챔버를 주입하십시오. 성공적인 관류는 간 색이 빨간색에서 옅은 분홍색으로 변하게 됩니다.
모든 PBS가 전달되면 2 분 동안 PBS에서 약 10 밀리리터4 %의 파라 포름알데히드로 심장을 견딜 수 있습니다. 머리를 수확 한 후 가위를 사용하여 두개골을 노출시키기 위해 두피에 중간 선 절개를합니다. 두개골의 측면 절개를 눈으로 만드는 것을 용이하게하기 위해 가위의 한 끝을 포라멘 매그넘에 놓습니다.
두개골의 반대편에 유사한 절개를 가능한 한 피상적으로 가위의 끝을 유지하고 눈과 마우스의 코 위에 두개골의 영역을 잘라. 집게를 사용하여 뇌 반구에서 두개골 뼈를 부드럽게 껍질을 벗기고 주걱을 사용하여 뇌를 상승시킵니다. 조심스럽게 두개골에 뇌를 고정하고 플라스틱 접시에 뇌를 배치 두개골 신경 섬유를 해부.
그런 다음 소뇌와 후각 전구를 소비합니다. 뇌 조직의 섹션을 얻으려면, 먼저 하룻밤 4 섭씨에서 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 채워진 15 밀리리터 튜브에서 뇌를 수정합니다. 다음 날 아침, 씻는 시간 당 신선한 PBS에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 적어도 세 번 뇌 조직을 헹구는다.
마지막 세척 후 가위와 집게로 각 반구의 전면을 제거하고 샘플을 라벨이 부착된 냉동 금형 전면에 배치합니다. 각 조직을 최적의 절삭 온도 매체에 담근 후 액체 질소로 샘플을 영하 80도의 플라스틱 페트리 접시에 고정시 섭씨 80도 까지 수납합니다. Xi재활성화를 결정하기 위해 항원 검색 용액에 5~6마이크로미터 뇌 조직 섹션을 100도 의 섭씨 열 블록에서 5분간 담급니다.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 실온에서 5분간 세척한 후 4분간 세척한 후 슬라이드를 블로킹 용액에 담급십시오. 실온에서 20분 후, 슬라이드를 세척당 신선한 세척 버퍼로 5분간 3회 세척합니다. 하룻밤 사이에 적절한 1 차 항체로 조직 샘플을 얼룩지게합니다.
형광 현미경의 슬라이드를 이미지하여 대조와 밝기를 조정하여 약물 및 차량 치료 마우스 뇌 반구모두에 대한 GFP 양성 세포의 수를 정량화할 수 있도록 합니다. 비무작위 X 염색체 불활성화 연구의 타당성을 입증하기 위해, 여성 형질성 마우스 배아 섬유아세포의 유전자형은 PCR 및 유동 세포측정에 의해 확인되었다. PCR에 의해 평가된 바와 같이, GFP 태그메틸렌 CPG 결합 단백질 2유전자 또는 MECP2의 발현은 약물에 의해 재활성화되었지만 차량 치료는 아니고.
비무작위 X 염색체 불활성화 마우스 모델 배아 섬유아세포는 또한 약물 후 핵 GFP를 발현하지만 X 염색체 불활성화 인자 억제제가 다시 활성화되지 않은 X 염색체를 보여주는 차량 치료는 마우스 배아 섬유아세포에서 MECP2를 연결했다. 약물 치료는 약물 주입 된 뇌 반구의 세포의 약 30 %에서 불활성화 X 염색체 MECP2-GFP를 다시 활성화하지만 차량 주입 반구에서 재활성화가 감지되지 않습니다. microtubule-관련 단백질 2 개의 양성 뉴런은 또한 불활성화 된 X 염색체 MECP2-GFP 발현을 나타내는 약물 처리 반구에서 양성이다.
약물 요법은 생체 내에서 테스트하기 전에 시험관내 투여량과 치료를 최적화하므로 작은 분자 억제제의 표적 및 효능에 의존하게 될 것이다. 비무작위 마우스 모델은 개별적으로 또는 조합하여 다른 약물을 테스트하는 데 활용할 수 있다. 사실, 우리 와 다른 몇 가지 약물 X 염색체 불 활성화 요인을 확인 했습니다.
