MeCP2蛋白质变异的电化学发光测定

ECLIA 是一种简单而有效的方法来量化 MeCP2 的细胞水平。与其他定量方法（如西方印迹和 ELISA）相比，ECLIA 速度快、更灵敏、更易于处理。要准备洗涤溶液，即 PBS 中的 0.5%Tween 20，请将 500 微升 Tween 20 添加到一升 PBS 中，并大力混合。

准备 3%阻滞器 A 和 PBS 的阻塞溶液，轻轻搅拌。通过过滤对堵塞溶液进行消毒。要准备测定稀释剂溶液，1%阻滞器 A 和 PBS，请向 10 毫升 PBS 添加 5 毫升的阻滞溶液。

接下来在冰上解冻单克隆小鼠抗 MeCP2 抗体。将抗体的0.67微升与4毫升PBS混合，然后涡旋溶液。为了溶液涂覆96井的高粘合板，使用多通道管道将25微升涂层溶液分入每井的底角。

将 96 井板轻轻涂抹在每侧，以确保涂层溶液覆盖每一个井的底部。用胶箔密封板，在摄氏四度下孵育过夜。从冰箱中取出 96 井板并取出铝箔。

将抗体涂层溶液轻拂到废容器中，将其去除。然后点按纸巾上的盘子，取出任何剩余的溶液。接下来，向每井添加 125 微升的阻塞解决方案。

然后用粘合箔再次密封板。将板放在轨道微孔板摇床上，设定为 800 RPM，并在室温下孵育 90 分钟。在冰上解冻一小瓶 MeCP2 或 Tat-MeCP2 蛋白质库存溶液、小鼠大脑解酶和 HDF 解酶。

稀释清洁管中的蛋白质储存溶液，如手稿表2所述。接下来稀释落酸样品。对于小鼠大脑解液，每25微升的解解缓冲液使用1至20微克。

对于 HDF 解酸，每 25 微升解液缓冲液中加入 0.25 至 1 微克。96 孔板孵育 90 分钟后，将堵塞溶液从孔中去除，将其轻拂到废物容器中。然后点按纸巾上的盘子，取出任何剩余的溶液。

然后用150微升的洗涤液洗三次，加入洗涤液并立即取出。在96孔板的井中加入25微升的标准和样品。密封板，并在室温下再孵育四小时，并持续 800 RPM 的震动。

在冰上解冻未标记的检测抗体，多克隆兔抗MCP2。使用测定稀释剂溶液，以1比6000的比例稀释抗体。当 96 井板在摇床上孵育完成后，通过将板轻拂到废容器中去除标准和样品。

然后点按纸巾上的盘子，取出任何剩余的溶液。加入洗涤液并立即取出，用150微升的洗涤溶液洗三次。使用多通道管道机将 25 微升无标签检测抗体溶液添加到每一井。

密封板并在室温下孵育一小时，在 800 RPM 下持续摇晃。从冰箱获得特定的二级抗体，并放置一块冰。在测定稀释剂溶液中稀释辅助体，轻轻混合。

要从 96 井板中去除无标签检测抗体，请轻拂到废容器中，然后用纸巾轻点板。洗涤板三次后，用多通道管道机将25微升的二次抗体添加到每井中。密封板并在室温下孵育一小时，在 800 RPM 下持续摇晃。

去掉释放的二次抗体，如前文所述，轻拂到废物容器中，用纸巾敲击盘子，然后洗三次盘子。在板的每个井中，加入150微升1X Tris基金读取缓冲器与表面活性剂，含有三叶胺作为光生成的核心活性剂。为避免产生气泡，请使用反向移液技术。

使用电化学发光检测系统，将 96 孔板放在微孔板上。使用内置的 CCD 摄像机，立即开始捕获数据。记录对应于相对光单位且与光强度成正比的信号计数。

MeCP2 标准曲线是在多次测量中从人类 MeCP2 生成的。ECLIA 可以精确量化重组人类 MeCP2 的范围，从每毫升一毫克到每毫升 1800 毫微克。使用ECLIA，MeCP2蛋白水平测量在脑核酸盐从异质和雌性野生型小鼠和一个梅CP2淘汰小鼠。

ECLIA是在细胞酸盐上进行的，来自健康对照组，以及用于使用为雷特综合征模型的c.806delG细胞系。ECLIA或免疫荧光在突变细胞系中未检测到 MeCP2 蛋白。

ECLIA还用于调查 MeCP2 缺陷细胞线路加班对 Tat-MeCP2 的吸收。在连续三天内测定了ECLIA间和内部测定精度。对于未来的蛋白质替代疗法，MeCP2的输送可以在ECLIA进行蛋白质水平评估后反复优化。