Este protocolo pode ser usado para gerar um modelo de rato não aleatório para testar e quantificar a reativação do cromossomo Icp2 atrelado ao X no cérebro de um rato vivo. Este modelo pode ser facilmente modificado para estudar a reativação de Xi em outros modelos de doenças ligadas ao X, como a síndrome DDX3X. Sou um pós-doutor no laboratório de Sanchita Bhatnagar e vou demonstrar o procedimento com Zeming Zheng.
Comece posicionando o mouse anestesiado em uma plataforma estereotática com os incisivos ligados na barra de mordida do conterrâneo focinho. Aperte o grampo do nariz enquanto mantém a cabeça do rato em um plano nivelado. Ajuste a altura das barras de ouvido para alcançar a porção caudal do canal auditivo para manter a cabeça imobilizada.
Em seguida, desinfete a cabeça com lenços alternados de um antisséptico tópico e 70% etanol. Quando o rato estiver pronto, use um bisturi estéril para fazer uma incisão horizontal de 0,75 centímetros no couro cabeludo médio. Use uma rebarba de 0,45 milímetros para perfurar dois orifícios simétricos acima dos hemisférios cortical direito e esquerdo a dois milímetros da sutura sagital e da sutura lambdoide no meio aproximado do osso parietal.
Conecte firmemente uma seringa de 10 microliteres à plataforma estereotática e carregue 10 microliters de inibidor químico recém-preparado na seringa. Avance a agulha para o primeiro orifício de rebarba enquanto mantém a agulha perpendicular ao crânio. Quando a agulha atravessar o crânio, zero as coordenadas do display digital estereotático e avance a ponta da agulha até atingir uma profundidade de 2,5 milímetros.
Retire a agulha 0,5 milímetros para uma profundidade de dois milímetros e injete lentamente todo o volume de 10 microliter da solução durante um período de um minuto. Depois que todo o inibidor tiver sido entregue, deixe a agulha no cérebro por mais um minuto antes de retirar a agulha. Repita a injeção no segundo orifício de rebarba usando o veículo apenas como controle e feche a pele sobre a incisão.
Em seguida, transfira o mouse do aparelho estereotático para uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus com monitoramento até a recuperação completa. No final do regime de dose, fixe o mouse em uma almofada de dissecação. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão lateral através do integumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica.
Separe cuidadosamente o fígado do diafragma e corte o diafragma ao longo de toda a extensão da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Use a tesoura para fazer uma incisão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete imediatamente a câmara cardíaca direita com aproximadamente 15 mililitros de PBS durante um período de dois minutos. Uma perfusão bem sucedida resultará em uma mudança de cor hepática de vermelho para rosa pálido.
Quando todo o PBS tiver sido entregue, perfunde o coração com aproximadamente 10 mililitros de 4% de paraformaldeído em PBS ao longo de dois minutos. Depois de colher a cabeça, use uma tesoura para fazer uma incisão no couro cabeludo para expor o crânio. Coloque uma ponta da tesoura no magnum forame para facilitar a criação de uma incisão lateral no crânio em direção ao olho.
Faça uma incisão semelhante do outro lado do crânio mantendo a extremidade da tesoura o mais superficial possível e corte a região do crânio entre os olhos e acima do nariz do rato. Use fórceps para descascar suavemente os ossos cranianos dos hemisférios cerebrais e usar uma espátula para elevar o cérebro. Dissecar cuidadosamente as fibras nervosas cranianas que fixam o cérebro no crânio e colocar o cérebro em um prato de plástico.
Em seguida, extirula o cerebelo e lâmpadas olfativas. Para obter seções do tecido cerebral, primeiro conserte o cérebro em um tubo de 15 mililitros preenchido com 4% de paraformaldeído na PBS a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue o tecido cerebral pelo menos três vezes por cinco minutos a quatro graus Celsius em PBS fresco por lavagem.
Após a última lavagem, remova a frente de cada hemisfério com tesouras e fórceps e coloque as amostras no lado frontal de crio-moldes rotulados para baixo. Submerse cada tecido em meio de temperatura de corte ideal antes de encaixar as amostras em nitrogênio líquido em uma placa de Petri de plástico de 10 milímetros por menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para determinar a reativação de Xi, mergulhe de cinco a seis seções de tecido cerebral em solução de recuperação de antígenos por cinco minutos em um bloco de calor de 100 graus Celsius.
No final da incubação, lave os slides com quatro lavagens de cinco minutos à temperatura ambiente com PBS fresco por lavagem antes de imergir os slides na solução de bloqueio. Depois de 20 minutos em temperatura ambiente, lave os slides três vezes por cinco minutos em tampão de lavagem fresco por lavagem. Manche as amostras de tecido com os anticorpos primários apropriados a quatro graus Celsius durante a noite.
Imagem dos slides em um microscópio de fluorescência ajustando o contraste e o brilho para permitir a quantificação do número de células positivas GFP para hemisférios cerebrais de camundongos tratados com drogas e veículos. Para demonstrar a viabilidade do modelo de camundongo de inativação do cromossomo X não aleatório para estudos inativos de reativação do cromossomo X, os genótipos do fibroblasto embrionário de camundongos transgênicos femininos foram confirmados por genotipagem PCR e citometria de fluxo. Conforme avaliado pelo PCR, a expressão da proteína de ligação de metileno CPG com etiqueta de GFP dois genes ou MECP2 foi reativada pela droga, mas não pelo tratamento veicular.
Os fibroblastos embrionários do cromossomo X não aleatórios também expressaram GFP nuclear após a droga, mas não o tratamento veicular demonstrando os inibidores do fator de inativação do cromossomo X reativam o cromossomo X inativado ligado MECP2 em fibroblastos embrionários de camundongos. O tratamento medicamentoso reativa o cromossomo X inativado MECP2-GFP em cerca de 30% das células em hemisférios cerebrais infundidos por drogas, enquanto nenhuma reativação é detectada em hemisférios infundidos de veículos. Proteína associada a microtúbulos dois neurônios positivos também são positivos em hemisférios tratados com drogas indicativos da expressão de cromossomo X inativado MECP2-GFP.
O regime de medicamentos dependerá do alvo e da eficácia dos inibidores de pequenas moléculas para otimizar a dose e o tratamento in vitro antes de testar in vivo. O modelo de mouse não aleatório pode ser utilizado para testar diferentes drogas individualmente ou em combinação. Na verdade, nós e outros identificamos vários fatores de inativação do cromossomo X drogado.
