通过对Rho激酶活性的暂时抑制,增强人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞的诱导

我们的数据表明，在将Rho-激酶活性的暂时抑制移植到梗塞动物心脏后，可增强粘附、存活和附着hiPSC衍生的心肌细胞。我们提供一种简单、低成本、高效的方法，以增加移植的hiPSC衍生心肌细胞在受伤动物心脏中的移植。由于该技术可以安全高效地提高急性心肌梗塞和心力衰竭中的细胞移植率，有助于改善心脏功能、血管和凋亡。

虽然我们只在hiPSC中测试了我们的协议，但这些方法可以应用于其他类型的细胞，如胚胎干细胞、中生期干细胞等。Y-27632治疗的剂量和持续时间至关重要。可视化演示可以非常详细地演示协议中的所有关键步骤，这对以前从未执行过此技术的人是有益的。

在hiPSC-CM分化后的第21天，吸气介质，用无菌PBS清洗细胞一次。每井在37摄氏度下用0.5毫升细胞分离酶孵育细胞5至7分钟。孵育时间后，使用一毫升移液器反复移液，以彻底分离细胞。

然后，将一毫升中和溶液添加到每一个井中，将细胞混合物收集在15毫升离心管中，以200倍g离心3分钟。离心后，丢弃上经剂，并在中和溶液中重新暂停细胞。然后，将细胞重新植入明胶涂层的六孔板上，密度为每孔200万个细胞。

24至48小时后，用净化介质更换培养介质3至5天。移植前，培养治疗组的细胞在RB+介质中培养12小时，辅以10微摩尔Y-27632。同样，用一微莫维帕米尔对RB+介质中的细胞进行12小时的维拉帕米尔治疗。

治疗后，用PBS清洗hiPSC-CMs一次，用每井0.5微升细胞分离酶孵育细胞，最多两分钟。使用单毫升移液器反复移液细胞悬浮液，以彻底分离细胞。接下来，用中和溶液中和细胞，将细胞混合物收集在15毫升离心管中，以200倍g离心3分钟。

离心后，每5微升的浓度为0.10万细胞，以制备注射。立即在心肌梗塞诱导后，将五微升控制hiPSC-CMs、Y-27632预处理的hiPSC-CMs、Verapamil治疗的hiPSC-CMs或相同体积的PBS注射到每个站点的小鼠心肌中，一个在梗塞区域，两个在梗塞周围区域。在进行钙瞬态和收缩检测前 12 小时，将 10 微摩尔 Y-27632、100 纳米摩尔 RA、1 微摩尔维拉帕米尔或等量的 PBS 添加到 hiPSC-CM 的培养介质中。

接下来，丢弃介质，用 PBS 清洗一次板。将介质更改为苯酚无红色 DMEM，每体积含有 0.02 重量，即表面活性质聚醇、五微摩尔钙指示器以及相应的 Y-27632、RA、verapamil 或等量的 PBS，并在 37 摄氏度下孵育板 30 分钟。孵育后，丢弃上经剂，用无染料DMEM洗涤细胞三次，让介质休息30分钟，使映射染料去酯化。

将细胞种子盖玻片放在开放式浴室中，通过自动温度控制器将室插入到平衡至 37 摄氏度的微孵化系统中。使用泰洛德的解决方案进行灌注，并将 RI、RA 或 PBS 不断添加到灌注解决方案中。使用倒置荧光显微镜和激光扫描头，通过 x-t 线扫描记录自发钙瞬态。

使用共合显微镜的差分干扰对比度功能记录 hiPSC-CMs 的自发收缩。移植细胞的存活率由荧光素酶活性增加得到证实。增加的人体心脏肌，T和人类核抗原表达表明，Y-27632预处理可以显著提高细胞移植率。

Y-27632预处理细胞表现出更大、更明确的棒状细胞骨骼结构。此外，Y-27632预处理减少了 TUNEL 阳性细胞，表明体内移植的 hiPSC-CM 凋亡减少。西方印迹表明，Y-27632预处理增加了蛋白β-1和N-卡德林的表达，并减少了磷-米奥辛光链2的表达。

此更改在 Y-27632 退出后 72 小时被规范化。体外小鼠HL-1细胞附着实验表明，Y-27632预处理显著增加了与HL-1相关的hiPSC-CM依从性。Y-27632预处理减少了收缩力、峰值钙瞬态荧光和钙瞬态持续时间。

Y-27632预处理通过显著减少cTnI和cTnT的表达来调节心肌细胞收缩。与Y-27632类似，维帕米尔预处理增加了荧光酶活性和hcTnT/HNA双阳性细胞的数量。最重要的步骤是培养治疗组的细胞在Rb+培养12小时，辅以10微摩尔Y-27632。

基于这种方法，慢释放Y-27632进一步提高细胞移植率是一个很有前途的策略。该技术为研究人员在体内研究CMshiPSC的生理学和功能铺平了道路。用于心肌细胞分化的小分子CHIR99021是危险的，可能导致呼吸刺激。

请不要吸入或吸入任何方式。