بياناتنا توضح أن تثبيط عابرة من نشاط Rho كيناز يعزز التصاق، والبقاء، وengraftment من القلب المشتقة من هيبسك بعد زرعها في قلوب الحيوانات المهجوعة. نحن نقدم بسيطة، منخفضة التكلفة، في حين أن طريقة عالية الكفاءة لزيادة engraftment من زرع هيبسك المشتقة من القلب في قلوب الحيوانات المصابة. كما يمكن أن تحسن هذه التقنية معدلات engraftment الخلايا بأمان وكفاءة في احتشاء القلب الحاد وفشل القلب، فإنه يساهم في التحسينات الناتجة في وظيفة القلب، والأوعية الدموية، و المبرمج.
على الرغم من أننا اختبرنا بروتوكولاتنا فقط في الـ(هيبس) إلا أن هذه الطرق يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من الخلايا، مثل الخلايا الجذعية الجنينية، والخلايا الجذعية الماسية، وما إلى ذلك. جرعة ومدة العلاج Y-27632 أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تظهر مظاهرة بصرية بقدر كبير من التفصيل جميع الخطوات الرئيسية في البروتوكول، وهو أمر مفيد لشخص لم يسبق له أن أدى هذه التقنية من قبل.
في اليوم 21 بعد التمايز hiPSC-CM، التعرق المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني عقيمة مرة واحدة. احتضان الخلايا مع 0.5 ملليلتر من إنزيمات تفكك الخلايا في بئر 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق. بعد فترة الحضانة، والماصات مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة ملليلتر واحد من أجل فصل الخلايا تماما.
ثم، إضافة ملليلتر واحد من حل تحييد لكل بئر، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في حل تحييد. ثم، إعادة زرع الخلايا على الجيلاتين المغلفة، لوحات ستة جيدا في كثافة مليوني خلية في البئر.
بعد 24 إلى 48 ساعة، استبدل الوسيطة الثقافية بوسيلة التنقية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام. قبل زرع, زرع الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB زائد المتوسطة تكمل مع 10-ميكرومولار Y-27632. وبالمثل، إجراء العلاج فيراباميل على الخلايا في المتوسط RB زائد مع ميكرومول واحد من فيراباميل لمدة 12 ساعة.
بعد العلاج، وغسل هيبسك-CMs مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة، واحتضان الخلايا مع 0.5 ميكرولترات من إنزيمات تفكك الخلايا في البئر لمدة أقصاها دقيقتين. الماص مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة ملليلتر واحد لتفكك الخلايا تماما. بعد ذلك، تحييد الخلايا مع تحييد الحل، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة ثلاث دقائق.
بعد الطرد المركزي، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز 0.1 مليون خلية لكل خمسة ميكرولترات استعدادا للحقن. مباشرة بعد احتشاء عضلة القلب التعريفي، حقن خمسة ميكرولترات من hiPSC السيطرة-CMs، Y-27632-pretreated hiPSC-CMs، فيراباميل المعالجة hiPSC-CMs، أو حجم متساو من برنامج تلفزيوني في عضلة القلب الماوس في كل موقع، واحد في منطقة هافيركت واثنين في المناطق المحيطة بالحفار. قبل 12 ساعة من إجراء الكشف عن الكالسيوم العابر والانكماشية ، أضف 10 ميكرومولار Y-27632 ، 100 نانومولار RA ، فيراباميل واحد ميكرومولار ، أو حجم متساو من PBS في وسط الثقافة من hiPSC-CMs.
بعد ذلك ، تجاهل المتوسطة ، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. تغيير المتوسطة إلى DMEM الحمراء خالية من الفينول التي تحتوي على 0.02 الوزن لكل حجم في المئة من البوليول السطحي، خمسة ميكرومولار الكالسيوم المؤشر، وY-27632 المقابلة، RA، فيراباميل، أو حجم متساو من برنامج تلفزيوني، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، والتخلص من اعمال، وغسل الخلايا مع DMEM خالية من الصبغة ثلاث مرات، والسماح للراحة المتوسطة لمدة 30 دقيقة ل de-استقريف صبغة رسم الخرائط.
ضع غطاء الخلايا المبذر في غرفة حمام مفتوحة، وأدخل الغرفة في نظام الدمج الدقيق المكافئ إلى 37 درجة مئوية مع وحدة تحكم تلقائية لدرجة الحرارة. Perfuse مع حل التيرود ، وإضافة مستمرة RI ، RA ، أو برنامج تلفزيوني إلى حل الضخ. استخدم مجهر الفلورانس المقلوب ورأس المسح الضوئي بالليزر لتسجيل عابر الكالسيوم التلقائي عن طريق استخدام مسح خط x-t.
سجل الانقباض التلقائي لـ hiPSC-CMs باستخدام وظيفة التباين التفاضلي للتداخل في المجهر confocal. تم تأكيد معدل البقاء على قيد الحياة للخلايا المزروعة من خلال زيادة نشاط لوسيفراز. أظهرت زيادة تروبونين القلب البشري T وتعبير المستضد النووي البشري أن المعالجة المسبقة Y-27632 يمكن أن تحسن بشكل كبير معدل نقادة الخلايا.
Y-27632 أظهرت الخلايا المعالجة المسبقة هيكل الهيكل العظمي على شكل قضيب أكبر وأكثر تحديدًا. أيضا، Y-27632 انخفض المعالجة المسبقة الخلايا الإيجابية موالف، مما يشير إلى انخفاض زرع hiPSC-CM المبرمج في الجسم الحي. واقترحت لطخة غربية أن Y-27632 قبل المعالجة زيادة التعبير عن بيتا-1 وN-cadherin انخفض التعبير عن سلسلة الضوء فوسفو-ثيوسين 2.
تم تطبيع هذا التغيير بعد 72 ساعة من انسحاب Y-27632. في المختبر الماوس HL-1 تجارب مرفق الخلية أشارت إلى أن Y-27632 قبل المعالجة زيادة كبيرة التزام hiPSC-CM نسبة إلى HL-1. Y-27632 قبل المعالجة خفضت قوة التقلص، وذرية الفلورية عابرة الكالسيوم، ومدة عابرة الكالسيوم.
Y-27632 قبل المعالجة ينظم انكماش القلب من خلال الحد بشكل كبير من التعبير عن cTnI و cTnT. على غرار Y-27632, فيراباميل المعالجة المسبقة زيادة نشاط لوسيفيراز وأعداد الخلايا الإيجابية المزدوجة hcTnT/HNA. الخطوة الأكثر أهمية هي زراعة الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB-plus المتوسطة تكملها 10 ميكرومولار Y-27632.
وبناء على هذه الطريقة، فإن الإفراج البطيء عن Y-27632 لزيادة معدل النقش الخلوي هو استراتيجية واعدة. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لدراسة علم وظائف الأعضاء ووظيفتها hiPSC من CMs في الجسم الحي. جزيء صغير CHIR99021 المستخدمة للتمايز cardiomyocytes خطرة، والتي قد تسبب تهيج في الجهاز التنفسي.
من فضلك لا تتناول أو تستنشق بأي شكل من الأشكال.
