Наши данные показывают, что переходное ингибирование активности родианазы усиливает адгезию, выживание и приписку кардиомиоцитов, полученных хиПСК, после пересадки в сердца животных. Мы предоставляем простой, недорогой, в то время как высокоэффективный метод для увеличения engraftment пересаженных hiPSC полученных кардиомиоцитов в сердцах раненых животных. Поскольку этот метод может улучшить показатели результации клеток безопасно и эффективно при остром инфаркте сердца и сердечной недостаточности, он способствует улучшению сердечной функции, сосудистости и апоптоза.
Хотя мы тестировали наши протоколы только в hiPSCs, эти методы могут быть применены к другим типам клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, и так далее. Доза и продолжительность лечения Y-27632 имеет решающее значение. Визуальная демонстрация может очень подробно продемонстрировать все ключевые шаги в протоколе, что выгодно для тех, кто никогда не выполнял эту технику раньше.
На 21 день после дифференциации hiPSC-CM, аспирировать средний и мыть клетки стерильными PBS один раз. Инкубировать клетки с 0,5 миллилитров клеточной диссоциации ферментов на колодец при 37 градусов по Цельсию в течение пяти-семи минут. После инкубации время, неоднократно pipette клеточной подвески с помощью одного миллилитров пипетки для того, чтобы тщательно разобщить клетки.
Затем добавьте по миллилитр нейтрализующий раствор в каждую колодец, соберите клеточную смесь в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 200 раз г в течение трех минут. После центрифугации отбросьте супернатант и повторно помекуйте клетки в нейтрализующий раствор. Затем пересаживаем клетки на пластины с покрытием желатина с шестью колодецами при плотности в два миллиона клеток на колодец.
Через 24-48 часов замените культурную среду средой очистки на три-пять дней. До трансплантации, культура клеток в группе лечения в течение 12 часов в РБ-плюс среды дополняется 10-микромоляной Y-27632. Аналогичным образом, выполнять верапамил лечения на клетках в РБ-плюс среды с одним микромоле верапамила в течение 12 часов.
После лечения, мыть hiPSC-CMs с PBS один раз, и инкубировать клетки с 0,5 микролитров клеточной диссоциации ферментов на хорошо в течение максимум двух минут. Неоднократно пипетка клеточной подвески с помощью одноми миллилитров пипетки тщательно разобщить клетки. Затем нейтрализуем клетки с нейтрализуя раствором, соберите клеточную смесь в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 200 раз г в течение трех минут.
После центрифугации, повторное использование клеток в PBS в концентрации 0,1 миллиона клеток на пять микролитров в рамках подготовки к инъекции. Сразу же после индукции инфаркта миокарда ввишите пять микролитров контроля hiPSC-CMs, Y-27632-pretreated hiPSC-CMs, verapamil-обработанные hiPSC-CMs, или равное количество PBS в миокарда мыши на каждом месте, один в области инфаркта и два в области вокруг infar. За 12 часов до выполнения кальция переходных и обнаружения контрактоемости, добавить 10-микромолярной Y-27632, 100-наномолярный РА, один микромолярный верапамил, или равный объем PBS в культуре среды hiPSC-CMs.
Затем отбросьте среду, и мыть пластину с PBS один раз. Измените среду на фенол красный без DMEM, содержащий 0,02 веса на объем процента сурфактанта полиола, пятимимолярный индикатор кальция, и соответствующие Y-27632, RA, verapamil, или равного объема PBS, и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, отбросить супернатант, мыть клетки с красителем, свободной DMEM три раза, и пусть средний отдых в течение 30 минут, чтобы де-эстерифицировать отображение красителя.
Поместите крышку с семенами клеток в открытую камеру ванны и вставьте камеру в систему микроинцуаровок, уравновешенную до 37 градусов по Цельсию с помощью автоматического контроллера температуры. Использовать его с раствором Tyrode, и постоянно добавлять RI, RA, или PBS в раствор перфузии. Используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп и лазерное сканирование головы для записи спонтанного преходящем кальция с помощью сканирования линии x-t.
Запись спонтанного сокращения hiPSC-CMs с использованием дифференциального интерференционного контраста функциональности конфокального микроскопа. Выживаемость пересаженных клеток была подтверждена повышенной активностью люциферазы. Увеличение человеческого сердечного тропонина Т и человеческого ядерного антигена выражение показало, что Y-27632 предварительной обработки может значительно улучшить скорость клетки engraftment.
Предварительно обработаемые клетки Y-27632 продемонстрировали большую и более определенную цитоскелетную структуру в форме стержня. Кроме того, Y-27632 предварительной обработки снижение TUNEL-положительных клеток, что свидетельствует о снижении пересаженных hiPSC-CM апоптоз in vivo. Западная помарка предложила что pretreatment Y-27632 увеличило выражение интегрина бета-1 и N-кадерина и уменьшило выражение цепи света фосфо-миозин 2.
Это изменение было нормализовано через 72 часа после вывода Y-27632. Эксперименты по вложению клеток in vitro HL-1 показали, что предварительная обработка Y-27632 значительно увеличила соблюдение hiPSC-CM по сравнению с HL-1. Предварительное лечение Y-27632 уменьшило контрактилинную силу, пик преходящей флуоресценции кальция и преходящую продолжительность кальция.
Y-27632 предлечение регулируется сокращением кардиомиоцитов за счет значительного снижения экспрессии cTnI и cTnT. Как и Y-27632, предлечение верапамилов увеличило активность люциферазы и количество двойных положительных клеток HCTnT/HNA. Наиболее важным шагом является культура клеток в группе лечения в течение 12 часов в Rb-плюс среды дополняется 10-микромолейной Y-27632.
Основываясь на этом методе, медленное высвобождение Y-27632 для дальнейшего увеличения скорости ферментации клеток является перспективной стратегией. Этот метод прокладывает путь для исследователей для изучения физиологии и функции hiPSC CMs in vivo. Небольшая молекула CHIR99021, используемая для дифференциации кардиомиоцитов, опасна, что может вызвать раздражение дыхательных путей.
Пожалуйста, не потребления или вдыхать каким-либо образом.
