우리의 데이터는 Rho-kinase 활동의 일시적인 억제가 극단적 인 동물 심장으로 이식 된 후 hiPSC 유래 심근 세포의 접착, 생존 및 이식을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 간단한, 저렴한 비용, 부상당한 동물 심혼에 이식 된 hiPSC 유래 심근 세포의 이식을 증가 하는 매우 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 기술은 급성 심장 경색및 심부전에서 세포 이식 속도를 안전하고 효율적으로 향상시킬 수 있으므로 심장 기능, 혈관 및 세포 마비의 결과로 개선됩니다.
우리는 hiPSCs에서 우리의 프로토콜을 시험하더라도, 이 방법은 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 등 세테라와 같은 세포의 그밖 모형에 적용될 수 있습니다. Y-27632 치료의 용량 과 기간은 매우 중요합니다. 시각적 데모는 프로토콜의 모든 주요 단계를 자세히 설명할 수 있으며, 이는 이전에 이 기술을 수행한 적이 없는 사람에게 유용합니다.
hiPSC-CM 분화 후 21일째에, 배지를 흡인하고 멸균 PBS로 세포를 한 번 세척한다. 세포에 세포를 배양하 0.5 밀리리터의 세포 해리 효소는 섭씨 37도에서 5~7분 동안 잘 섭취합니다. 인큐베이션 시간 후, 세포를 철저히 해리시키기 위해 1밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 반복적으로 피펫한다.
그런 다음 각 웰에 1 밀리리터의 중화 용액을 추가하고, 15밀리리터 원심분리기 튜브에 세포 혼합물을 수집하고, 원심분리기는 3분 동안 200배 g에서 수집합니다. 원심 분리 후, 상신체를 폐기하고 중화 용액에서 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음, 젤라틴 코팅, 6웰 플레이트에 세포를 잘 당 2백만 개의 세포밀도로 심는다.
24~48시간 후, 배양배지를 3~5일 동안 정화배지로 교체한다. 이식 전에, 10 마이크로몰러 Y-27632로 보충된 RB 플러스 배지에서 12시간 동안 치료군에서 세포를 배양한다. 유사하게, 12 시간 동안 verapamil의 1 개의 마이크로몰로 RB 플러스 배지의 세포에 verapamil 처리를 수행합니다.
치료 후, PBS로 hiPSC-CM을 한 번 세척하고 세포 해리 효소의 0.5 마이크로리터로 세포를 최대 2분 동안 배양한다. 세포를 철저히 해리하기 위해 1밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 반복적으로 피펫합니다. 다음으로, 중화 용액으로 세포를 중화시키고, 15밀리리터 원심분리기 튜브에서 세포 혼합물을 수집하고, 원심분리기는 3분 동안 200배 g에서 수집한다.
원심분리 후, 주입을 준비하기 위해 5개의 마이크로리터 당 0.1백만 개의 세포의 농도로 PBS의 세포를 다시 중단한다. 심근 경색 유도 직후, 제어 hiPSC-CM, Y-27632-pretreated hiPSC-CM, verapamil 처리 hiPSC-CM, 또는 각 부위의 마우스 심근에 PBS의 동등한 부피, 각 부위에 있는 마우스의 심근막에 PBS의 동등한 부피, 원거리 지역에 1개, 그리고 그 주변 지역에 있는 2개의 마이크로리터를 주입한다. 칼슘 일시및 수축 검출을 수행하기 12시간 전에, 10마이크로몰러 Y-27632, 100나노몰라 RA, 1마이크로몰러 베라파밀 또는 동일한 양의 PBS를 hiPSC-CM의 배양 배지에 추가한다.
다음으로, 매체를 버리고, 한 번 PBS로 접시를 씻는다. 계면 활성제 폴리올의 부피 퍼센트당 0.02 중량을 함유한 페놀 무적DMEM, 5마이크로몰라 칼슘 표시기 및 해당 Y-27632, RA, verapamil 또는 PBS의 동일한 부피를 포함하는 페놀 무적DMEM으로 배지를 변경하고 30분 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 인큐베이션 후, 상체를 버리고, 염료가 없는 DMEM으로 세포를 세 번 세척하고, 중간 체질을 30분 동안 쉬게 하여 매핑 염료를 제거한다.
세포 씨 덮개 슬립을 열린 목욕 챔버에 놓고 자동 온도 컨트롤러로 섭씨 37도에 달하는 미세 배양 시스템에 챔버를 삽입합니다. Tyrode의 솔루션으로 퍼퓨즈하고 관류 용액에 RI, RA 또는 PBS를 지속적으로 추가합니다. 반전형 형광 현미경과 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 X-t 라인 스캔을 사용하여 자발적인 칼슘 과도를 기록합니다.
공초점 현미경의 차동 간섭 대비 기능을 사용하여 hiPSC-CM의 자발적인 수축을 기록합니다. 이식된 세포의 생존율은 증가된 루시파아제 활성에 의해 확인되었다. 증가 된 인간의 심장 트로포닌 T와 인간의 핵 항 원 발현 Y-27632 전처리 세포 이식 속도를 크게 향상 시킬 수 있음을 보여주었다.
Y-27632 전처리 된 세포는 더 크고 더 정의 된 막대 모양의 사이토켈레탈 구조를 나타냈다. 또한, Y-27632 전처리는 TUNEL 양성 세포를 감소시켰으며, 이는 생체내에서 이식된 hiPSC-CM 세포멸을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 Y-27632 전처리가 인테그린 베타-1 및 N-cadherin의 발현을 증가시키고 인산 미오신 광사슬 2의 발현을 감소시켰다.
이 변경은 Y-27632 철수 후 72 시간 정상화되었다. 시험관 내 마우스 HL-1 세포 부착 실험은 Y-27632 전처리가 HL-1에 비해 hiPSC-CM 준수를 현저히 증가시켰다는 것을 나타냈다. Y-27632 전처리는 수축력, 피크 칼슘 과도 형광 및 칼슘 과도 지속 시간을 감소시었습니다.
Y-27632 전처리는 cTnI 및 cTnT의 발현을 현저히 감소시킴으로써 심근세포 수축을 조절했다. Y-27632와 마찬가지로, 베라파밀 전처리는 루시파라제 활성및 hcTnT/HNA 이중 양성 세포의 수를 증가시켰습니다. 가장 중요한 단계는 10 마이크로몰라 Y-27632로 보충된 Rb 플러스 배지에서 12시간 동안 치료 군내 세포를 배양하는 것이다.
이 방법에 기초하여, 세포 이식 속도를 더욱 높이기 위해 Y-27632의 느린 방출은 유망한 전략이다. 이 기술은 연구원이 생체 내 CM의 hiPSC의 생리학 그리고 기능을 연구하는 쪽을 포장합니다. 심근세포 분화에 사용되는 작은 분자 CHIR99021은 호흡기 자극을 일으킬 수 있는 위험합니다.
어떤 식으로든 흡입하거나 흡입하지 마십시오.
