下颌骨和腮腺表型模型对组织型培养的放射治疗是机体活力特征的关键

该协议允许评估组织内不同细胞类型之间的细胞相互作用，以及体内不太可行的体外分子和药理操作。这种技术的主要优点是，这些组织部分可以在培养中保持较长时间，从而可以在以后的点进行评估。这项技术将允许更快速地筛选治疗化合物，以纠正唾液腺损伤，并可能减少用于这些研究的小鼠数量。

我们计划使用这种技术来了解唾液腺在中间时间点对放射治疗的反应，并在特定时间间隔打开和关闭基因。这个过程最困难的方面是组织切块和防止在培养和染色步骤中失去组织部分。在开始手术之前，用70%乙醇对可拆卸振动组组件进行消毒，然后进行紫外线灭菌至少30分钟。

在缓冲盘上再固定一片实验室薄膜，以防止冰入冰，并在冰室中加满碎冰。从缓冲盘中取出实验室薄膜，用 100 毫升冰冷的 PBS 填充缓冲盘，并辅以 1% 青霉素链霉素（PSA） 或 PSA。然后将不锈钢剃须刀刀片放入刀片支架中，并使用螺丝刀促进刀片角度的调整。

隔离唾液腺后，将收获的组织放入一个无菌的30毫米培养皿中，其中含有两毫升冰冷的PBS，并辅以1%PSA。使用自洗钳，将腺体转移到嵌入模具的底部，用液体3%的低熔点气糖覆盖组织。使用钳子，将组织调整到适当平面的方块中间，并在冰上放置红糖块 10 分钟。

当气糖硬化时，小心地在模具的外边缘运行剃须刀刀片，让块滑出到紫外线消毒实验室薄膜上。使用剃须刀刀片切出含有唾液腺的红玫瑰盒，注意截面的平面是直的，平行于块的对面。使用超胶将块连接到切割表面，以 100 赫兹的频率以 0.075 毫米/秒的速度在振动器上获得 50 或 90 微米厚的截面。

然后使用自 <3>发天然发刷将部分转移到24孔组织培养皿的单个孔中，每孔都含有一毫升冰冷的PBS。当所有部分都获得时，使用和自动处理微铲将各部分转移到单独的0.4微米浇注大小膜中，插入每个孔的24孔组织培养板中，每口含有300微升振动培养培养介质。然后将板放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中，湿度大，刷新每个井底的介质，并根据需要每隔一天向膜中加入40微升的介质，最多30天。

要照射组织，请将部分转移到覆盖的发泡胶容器中的辐照器设施，以避免温度波动，并用单一五级剂量的辐射处理这些部分。然后将培养物返回到辐射安全组织培养箱。对于组织部分的抗体染色，在无菌 PBS 中至少洗涤两个 5 分钟，并在四摄氏度下将样品在 4%的甲醛中固定。

第二天早上用PBS洗三次，辅以1%牛血清白蛋白和0.1%Triton X-100，或PBT，然后用PBS中的0.3%Triton X-100渗透组织30分钟。如同在阻断任何非特异性结合之前，用1%的正常山羊血清补充1%的正常山羊血清，在阻断任何非特异性结合之前，在PBT中清洗部分三次。然后在感兴趣的适当原抗体中孵育部分过夜。

初级 2D 唾液腺部分培养物的明亮场显微镜图像显示，在所测试的所有血清补充剂浓度下，可存活组织存在长达 30 天的培养。Ki-67免疫着色评估了这些代表性培养切片的增殖能力，并在评估的所有时间点都观察到了该标记。在所有时间点也观察到低水平的裂开的卡斯帕斯-3阳性细胞，在第30天检测到少量增加。

在30天的培养期中，在亚曼地膜和帕罗蒂腺切片中观察到E-卡德林染色。平滑肌肉行为素阳性细胞和细胞骨骼组织在整个培养期在类似的水平被检测。同样，也检测到淀粉酶和水孢素-5等功能蛋白，尽管在第14天染色似乎更精细。

相比之下，CD31和图巴3在整个腺体的培养期没有一致地表达，这表明在30天培养期的不同时期中，组织成分的多样性。两个腺体的辐照切片模仿在体内观察到的类似增殖凋亡和细胞骨骼变化。将振动器中的 PBS 浴池移动到培养板以及染色过程中，小心，因为部分较小且细腻。

在大多数细胞系培养方法中，可以处理节培养物，其附加好处是在与体内关系更密切的条件下。我们预计，这将是一个强大的技术，其他研究人员纳入他们的实验。振动器上的刀片很锋利，可能难以插入，因此在操作时要疲倦。

也 trypan 蓝色染料是有毒和致癌的， 所以遵循所有 Pp 指南。