Este protocolo permite a avaliação das interações celular-célula entre diversos tipos de células dentro de um tecido, e ex vivo manipulações moleculares e farmacológicas que seriam menos viáveis in vivo. A principal vantagem dessa técnica é o longo período de tempo que essas seções teciduais poderiam ser mantidas na cultura permitindo sua avaliação em momentos posteriores. Esta técnica permitirá uma triagem mais rápida de compostos terapêuticos para corrigir danos nas glândulas salivares e provavelmente reduzirá o número de camundongos usados para esses estudos.
Planejamos usar essa técnica para entender a resposta da glândula salivar à radioterapia em pontos de tempo intermediários e ligar e desligar genes em intervalos específicos. O aspecto mais difícil deste procedimento é a seção tecidual e a prevenção da perda de seções teciduais durante as etapas de cultura e coloração. Antes de iniciar o procedimento, desinfetar os componentes destacáveis do vibratome com 70% de etanol, seguidos pela esterilização UV por pelo menos 30 minutos.
Fixar uma folha adicional de filme de laboratório sobre a bandeja de tampão para evitar que o gelo caia, e encha a câmara de gelo com gelo esmagado. Remova o filme de laboratório da bandeja de tampão e encha a bandeja de tampão com 100 mililitros de PBS gelado suplementado com estreptomiclina de 1%penicillina, ou PSA. Em seguida, coloque uma lâmina de barbear de aço inoxidável no suporte da lâmina e use uma chave de fenda para facilitar o ajuste do ângulo da lâmina.
Depois de isolar as glândulas salivares, coloque o tecido colhido em um prato de cultura estéril de 30 milímetros contendo dois mililitros de PBS gelado suplementado com 1%PSA. Usando fórceps autoclavados, transfira as glândulas para o fundo do molde de incorporação e cubra o tecido com um ponto de fusão líquido 3% baixo. Usando fórceps, ajuste o tecido para o meio do bloco no plano apropriado, e coloque o bloco de agarose no gelo por 10 minutos.
Quando a agarose tiver endurecido, execute cuidadosamente uma lâmina de barbear ao redor da borda externa do molde e deixe o bloco deslizar para fora para o filme de laboratório esterilizado por UV. Use a lâmina de barbear para cortar uma caixa de agarose contendo a glândula salivar, tomando cuidado para que o plano da seção esteja reto e paralelo ao lado oposto do bloco. Use supercola para anexar o bloco à superfície de corte e obter seções de 50 ou 90 micrômetros de espessura no vibratome a uma velocidade de 0,075 milímetros por segundo a uma frequência de 100 hertz.
Em seguida, use uma escova de tinta de cabelo natural autoclavada para transferir as seções para poços individuais de um prato de cultura de tecido de 24 poços contendo um mililitro de PBS gelado por bem como eles são obtidos. Quando todas as seções tiverem sido adquiridas, use e autoclaved micro espátula para transferir as seções para inserções individuais de membrana de tamanho de derramamento de 0,4 micrômetros em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços contendo 300 microliters de cultura vibratome meio por poço. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade, refrescando o meio na parte inferior de cada poço, e adicionando 40 microliters de média às pastilhas de membrana a cada dois dias, conforme necessário por até 30 dias.
Para irradiar os tecidos, transfira as seções para a instalação do irradiador em um recipiente de isopor coberto para evitar flutuações na temperatura e tratar as seções com uma única dose de cinco graus de radiação. Em seguida, devolva as culturas para uma incubadora de cultura de tecido seguro de radiação. Para coloração de anticorpos das seções teciduais, lave as amostras com pelo menos duas lavagens de cinco minutos em PBS estéreis e fixe as seções em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius durante a noite.
Na manhã seguinte, lave as seções três vezes com PBS complementada com albumina de soro bovino de 1%e 0,1%Triton X-100, ou PBT, antes de permeabilizar os tecidos com 0,3%Triton X-100 em PBS por 30 minutos. Lave as seções três vezes em PBT como demonstrado antes de bloquear qualquer ligação inespecífica com agente de bloqueio complementado com soro de cabra 1% normal por uma hora. Em seguida, incubar as seções durante a noite no anticorpo primário apropriado de interesse.
Imagens de microscópio de campo brilhante das culturas primárias da seção das glândulas salivares 2D revelam a presença de tecidos viáveis por até 30 dias de cultura sob todas as concentrações de suplementação sérica testada. A capacidade proliferativa dessas fatias cultivadas representativas foi avaliada pela imunostaining Ki-67 e esse marcador foi observado em todos os pontos de tempo avaliados. Um baixo nível de células positivas Cleaved Caspase-3 também foi observado em todos os pontos de tempo com um pequeno aumento detectado no dia 30.
A coloração de e-cadherin foi observada nas fatias de glândulas submandibulares e parótidas durante o período cultural de 30 dias. Células musculares lisas actin-positivas e organização citoesquelético foram detectadas em níveis semelhantes durante todo o período de cultura. Da mesma forma, proteínas funcionais como amilase e aquaporina-5 também foram detectadas, embora no dia 14 a coloração parecesse ser mais granular.
Em contrapartida, o CD31 e o TUBB3 não foram consistentemente expressos ao longo do período cultural em ambas as glândulas, sugerindo que há uma diversidade de componentes teciduais mantidos por diferentes períodos de tempo ao longo do período cultural de 30 dias. Fatias irradiadas em ambas as glândulas imitavam alterações apoptóticas e citosqueléticas semelhantes observadas in vivo. Tenha cuidado ao mover as seções do banho pbs no vibratome para a placa de cultura e durante os procedimentos de coloração, pois as seções são pequenas e delicadas.
As culturas de seção podem ser tratadas com a maioria dos métodos de cultura de linha celular com o benefício adicional de estar em condições mais próximas ao in vivo. Prevemos que esta será uma técnica poderosa para outros pesquisadores incorporarem em seus experimentos. A lâmina no vibratome é afiada e pode ser difícil de inserir, por isso esteja cansado ao manusear.
Também o corante azul trypan é tóxico e cancerígeno, então siga todas as diretrizes de PP.
