Este protocolo permite la evaluación de las interacciones de células a células entre diversos tipos de células dentro de un tejido, y manipulaciones moleculares y farmacológicas ex vivo que serían menos factibles in vivo. La principal ventaja de esta técnica es el largo período de tiempo que estas secciones tisulares podrían mantenerse en el cultivo permitiendo su evaluación en puntos de tiempo posteriores. Esta técnica permitirá un cribado más rápido de compuestos terapéuticos para corregir el daño de las glándulas salivales y probablemente reducirá el número de ratones utilizados para estos estudios.
Planeamos utilizar esta técnica para entender la respuesta de la glándula salival a la radioterapia en puntos de tiempo intermedios y para activar y desactivar los genes a intervalos específicos. El aspecto más difícil de este procedimiento es la sección del tejido y la prevención de la pérdida de secciones tisulares durante los pasos de cultivo y tinción. Antes de comenzar el procedimiento desinfectar los componentes vibratomos desmontables con 70%etanol, seguido de esterilización UV durante al menos 30 minutos.
Asegure una hoja adicional de película de laboratorio sobre la bandeja tampón para evitar que caiga hielo, y llene la cámara de hielo con hielo triturado. Retire la película de laboratorio de la bandeja tampón y llene la bandeja tampón con 100 mililitros de PBS helado complementado con 1%penicilina ampicilina ampicilina, o PSA. A continuación, coloque una cuchilla de afeitar de acero inoxidable en el soporte de la hoja y utilice un destornillador para facilitar el ajuste del ángulo de la hoja.
Después de aislar las glándulas salivales, coloque el tejido cosechado en un plato de cultivo estéril de 30 milímetros que contenga dos mililitros de PBS helado complementado con 1%PSA. Usando fórceps autoclaves, transfiera las glándulas a la parte inferior del molde incrustado y cubra el tejido con líquido 3% bajo punto de fusión agarosa. Usando fórceps, ajuste el tejido a la mitad del bloque en el plano apropiado y coloque el bloque de agarosa sobre hielo durante 10 minutos.
Cuando la agarosa se haya endurecido, ejecute cuidadosamente una cuchilla de afeitar alrededor del borde exterior del molde y deje que el bloque se deslice hacia la película de laboratorio esterilizada con UV. Utilice la cuchilla de afeitar para cortar una caja de agarosa que contiene la glándula salival, teniendo cuidado de que el plano de la sección sea recto y paralelo al lado opuesto del bloque. Utilice superpegamento para fijar el bloque a la superficie de corte y obtener secciones de 50 o 90 micrómetros de espesor en el vibratome a una velocidad de 0,075 milímetros por segundo a una frecuencia de 100 hercios.
Luego usa un cepillo de pintura de cabello natural autoclavizado para transferir las secciones a pozos individuales de un plato de cultivo de tejido de 24 pozos que contenga un mililitro de PBS helado por su parte, ya que se obtienen. Una vez adquiridas todas las secciones, utilice y autoclave micro espátula para transferir las secciones a inserciones individuales de membrana de tamaño de vertido de 0,4 micrómetros en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos que contiene 300 microlitros de medio de cultivo de vibratoma por pozo. A continuación, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%con humedad, refrescándolo en la parte inferior de cada pozo y añadiendo 40 microlitros de medio a la membrana se inserta cada dos días según sea necesario durante un máximo de 30 días.
Para irradiar los tejidos, transfiera las secciones a la instalación del irradiador en un recipiente cubierto de espuma de poliestireno para evitar fluctuaciones en la temperatura y tratar las secciones con una sola dosis de radiación de cinco grados. Luego devuelva los cultivos a una incubadora de cultivo de tejido segura contra radiación. Para la tinción de anticuerpos de las secciones del tejido, lave las muestras con al menos dos lavados de cinco minutos en PBS estéril y fije las secciones en 4%paraformaldehído a cuatro grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente lavar las secciones tres veces con PBS complementado con 1%albúmina sérica bovina y 0.1%Tritón X-100, o PBT, antes de permeabilizar los tejidos con 0.3%Tritón X-100 en PBS durante 30 minutos. Lavar las secciones tres veces en PBT como se ha demostrado antes de bloquear cualquier unión inespecífico con agente bloqueador complementado con 1%suero de cabra normal durante una hora. Luego incubar las secciones durante la noche en el anticuerpo primario de interés apropiado.
Imágenes brillantes del microscopio de campo de cultivos primarios de sección de glándulas salivales 2D revelan la presencia de tejidos viables para hasta 30 días de cultivo bajo todas las concentraciones de suplementos séricos probados. La capacidad proliferativa de estas rebanadas cultivadas representativas fue evaluada por la inmunostaining Ki-67 y este marcador se observó en todos los puntos de tiempo evaluados. También se observó un nivel bajo de células positivas de Caspase-3 en todos los momentos con un pequeño aumento detectado en el día 30.
Se observó tinción de cadherina en las rodajas de glándula submandibular y parótida durante el período de cultivo de 30 días. Las células de actina positiva lisa y la organización citoesquelética se detectaron a niveles similares durante todo el período de cultivo. Del mismo modo, también se detectaron proteínas funcionales como la amilasa y la aquaporina-5, aunque en el día 14 la tinción parecía ser más granular.
Por el contrario, CD31 y TUBB3 no se expresaron consistentemente a lo largo del período de cultivo en ambas glándulas, lo que sugiere que hay una diversidad de componentes tisulares mantenidos durante diferentes períodos de tiempo durante el período de cultivo de 30 días. Las rodajas irradiadas en ambas glándulas imitaron cambios apoptóticos y citoesqueléticos proliferativos similares observados in vivo. Tenga cuidado al mover las secciones del baño PBS en el vibratome a la placa de cultivo y durante los procedimientos de tinción, ya que las secciones son pequeñas y delicadas.
Los cultivos de sección se pueden tratar con la mayoría de los métodos de cultivo de líneas celulares con el beneficio adicional de estar en condiciones que están más estrechamente relacionadas con in vivo. Anticipamos que esta será una técnica poderosa para que otros investigadores se incorporen a sus experimentos. La hoja del vibratome es afilada y puede ser difícil de insertar, así que esté cansado al manipularla.
También el tinte azul trypan es tóxico y cancerígeno, así que siga todas las pautas del PP.
