Bu protokol, hücrenin doku içindeki çeşitli hücre tipleri arasındaki hücre etkileşimlerinin değerlendirilmesi ve vivo'da daha az uygulanabilir olacak eski vivo moleküler ve farmakolojik manipülasyonların değerlendirilmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu doku bölümlerinin kültürde daha sonraki zaman noktalarında değerlendirilmelerine olanak sağlayan uzun süre yitirilmesidir. Bu teknik tükürük bezi hasarı düzeltmek için terapötik bileşiklerin daha hızlı bir tarama sağlayacak ve büyük olasılıkla bu çalışmalar için kullanılan fare sayısını azaltacaktır.
Bu tekniği, ara zaman noktalarında radyoterapiye tükürük bezi yanıtını anlamak ve genleri belirli aralıklarla açıp kapatmak için kullanmayı planlıyoruz. Bu işlemin en zor yönü doku kesiti ve kültür ve boyama adımları sırasında doku kesitlerinin kaybını önlemektir. İşleme başlamadan önce çıkarılabilir vibratom bileşenlerini %70 etanol ile dezenfekte edin ve ardından uv sterilizasyonunu en az 30 dakika boyunca uygulayın.
Buzun düşmesini önlemek için tampon tepsinin üzerine ek bir laboratuvar filmi kağıdı yerleştirin ve buz haznesini ezilmiş buzla doldurun. Tampon tepsiden laboratuvar filmini çıkarın ve tampon tepsiyi %1 penisilin streptomisin ampisilin veya PSA ile birlikte 100 mililitre buz gibi PBS ile doldurun. Daha sonra bıçak tutucuya paslanmaz çelik jilet yerleştirin ve bıçağın açısının ayarını kolaylaştırmak için bir tornavida kullanın.
Tükürük bezleri izole sonra, steril bir içine hasat doku yerleştirin 30 milimetrelik bir kültür çanak buz gibi pbs iki mililitre içeren 1% PSA ile takviye. Otoklavlı forceps kullanarak, kalıbın altına bezleri aktarın ve sıvı ile doku kapağı 3%düşük erime noktası agarose. Forseps kullanarak, uygun düzlemde bloğun ortasına doku ayarlayın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde agarose blok yerleştirin.
Agarose sertleştiğinde, kalıbın dış kenarına dikkatlice jilet çalıştırın ve bloğun UV sterilize edilmiş laboratuvar filmine kaymasına izin verin. Tükürük beziiçeren bir agarose kutusunu kesmek için jilet kullanın, bölümün düzlemi düz ve bloğun karşı tarafına paralel olduğunu özen. Bloğu kesme yüzeyine takmak için süper yapıştırıcı kullanın ve 100 hertz frekansTa saniyede 0,075 milimetre hızda vibratom üzerinde 50 veya 90 mikrometre kalınlığında kesitler elde edin.
Daha sonra, bölümleri, elde edilen buz gibi pbs bir mililitre içeren 24 kuyu doku kültürü çanak bireysel kuyular içine aktarmak için bir otoklavlı doğal saç boya sıcağı kullanın. Tüm bölümler edinildiğinde, kullanım ve otoklavlı mikro spatula tek tek 0.4 mikrometre dökmek boyutu membran ekler her kuyuda 24 kuyu doku kültür plakası içeren 300 vibratom kültür orta kuyusu başına 300 mikrolitre. Daha sonra plakayı nem oranı yla birlikte 37 derece santigrat derece ve %5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin, her kuyunun alt kısmındaki orta yısınve 30 güne kadar gerektiği gibi her gün membran astarlarına 40 mikrolitre orta madde ekleyin.
Dokuları ışınlamak için, sıcaklık dalgalanmaları önlemek ve radyasyon tek bir beş sınıf doz ile bölümleri tedavi etmek için kapalı bir strafor konteyner içinde ışınlayıcı tesise bölümleri aktarın. Sonra kültürleri radyasyondan korunmaya karşı doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Doku bölümlerinin antikor boyama için, steril PBS en az iki beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın ve dört derece santigrat bir gecede% 4 paraformaldehit bölümleri düzeltmek.
Ertesi sabah pbs ile üç kez yıkama küçülme % 1 sığır serum albumin ve 0.1% Triton X-100 veya PBT ile takviye, 30 dakika pbs 0.3% Triton X-100 ile dokuları permeabilizing önce. Bir saat boyunca %1 normal keçi serumu ile takviye edilen bloke edici ajanile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engellemeden önce pbt'de üç kez bölümleri yıkayın. Daha sonra ilgi uygun birincil antikor gecede bölümleri kuluçka.
Primer 2D tükürük bezi kesit kültürlerinin parlak alan mikroskop görüntüleri test serum takviyesi tüm konsantrasyonları altında kültür 30 güne kadar canlı dokuların varlığını ortaya koymaktadır. Bu temsili kültür dilimlerinin proliferatif kapasitesi Ki-67 immünboyama ile değerlendirildi ve bu işarether zaman değerlendirme noktasında gözlendi. Cleaved Caspase-3 pozitif hücrelerin düşük düzeyde de 30 gün tespit küçük bir artış ile her zaman noktalarında gözlendi.
30 günlük kültür dönemi boyunca hem submandibular hem de parotis bezi dilimlerinde e-kadherin boyama gözlendi. Düz kas aktin pozitif hücreleri ve sitosiskelet organizasyonu kültür dönemi boyunca benzer düzeylerde saptandı. Benzer şekilde, amilaz ve aquaporin-5 gibi fonksiyonel proteinler de tespit edildi, 14.
Buna karşılık, CD31 ve TUBB3 her iki bezde de kültür dönemi boyunca sürekli olarak ifade edilmemiştir ve 30 günlük kültür dönemi boyunca farklı dönemlerde tutulan doku bileşenlerinin çeşitliliği olduğunu düşündürmektedir. Her iki bezde ışınlanmış dilimler benzer proliferatif apoptotik ve sitoskeletal değişiklikleri taklit in vivo gözlendi. Bölümler küçük ve hassas olduğu için vibratomdaki PBS banyosundaki bölümleri kültür plakasına ve boyama işlemleri sırasında hareket ettirirken dikkatli olun.
Kesit kültürleri in vivo ile daha yakından ilişkili koşullar altında olmanın yararı ile en hücre hattı kültür yöntemleri ile tedavi edilebilir. Bunun diğer araştırmacıların deneylerine dahil etmeleri için güçlü bir teknik olacağını tahmin ediyoruz. Vibratom üzerindeki bıçak keskindir ve elleçleme yaparken yorgun olmak için eklemek zor olabilir.
Ayrıca trypan mavi boya toksik ve kanserojen bu yüzden tüm PP yönergeleri izleyin.
