Dieses Protokoll ermöglicht die Auswertung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes und ex vivo molekularen und pharmakologischen Manipulationen, die in vivo weniger möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der längere Zeitraum, in dem diese Gewebeabschnitte in der Kultur beibehalten werden könnten, so dass ihre Bewertung zu späteren Zeitpunkten möglich ist. Diese Technik wird ein schnelleres Screening von therapeutischen Verbindungen ermöglichen, um Speicheldrüsenschäden zu korrigieren und wird wahrscheinlich die Anzahl der Mäuse reduzieren, die für diese Studien verwendet werden.
Wir planen, diese Technik zu verwenden, um die Speicheldrüsenreaktion auf Diebstrahlung zu Zwischenzeitpunkten zu verstehen und Gene in bestimmten Intervallen ein- und auszuschalten. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewebesektion und verhindert den Verlust von Gewebeabschnitten während der Kultur- und Färbeschritte. Vor Beginn des Verfahrens desinfizieren Sie die abnehmbaren Vibram-Komponenten mit 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Sterilisation für mindestens 30 Minuten.
Sichern Sie eine zusätzliche Platte Laborfolie über der Pufferschale, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt, und füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis. Entfernen Sie die Laborfolie aus der Pufferschale und füllen Sie die Pufferschale mit 100 Millilitereiskaltem PBS, ergänzt mit 1%Penicillin Streptomycin Ampicillin oder PSA. Legen Sie dann eine Rasierklinge aus Edelstahl in den Klingenhalter und verwenden Sie einen Schraubendreher, um die Einstellung des Winkels der Klinge zu erleichtern.
Nach der Isolierung der Speicheldrüsen, legen Sie das geerntete Gewebe in eine sterile 30-Millimeter-Kulturschale mit zwei Millilitereis-kalte PBS mit 1%PSA ergänzt. Mit autoklavierten Zangen, übertragen Sie die Drüsen auf den Boden der Einbettform und bedecken Sie das Gewebe mit flüssigen 3%niedriger Schmelzpunkt Agarose. Mit Zangen, stellen Sie das Gewebe auf die Mitte des Blocks in der entsprechenden Ebene, und legen Sie den Agarose-Block auf Eis für 10 Minuten.
Wenn die Agarose gehärtet ist, führen Sie vorsichtig eine Rasierklinge um den äußeren Rand der Form und lassen Sie den Block auf den UV-sterilisierten Laborfilm gleiten. Verwenden Sie die Rasierklinge, um eine Agarose-Box mit der Speicheldrüse auszuschneiden, wobei darauf geachtet wird, dass die Ebene des Abschnitts gerade und parallel zur gegenüberliegenden Seite des Blocks ist. Verwenden Sie Superkleber, um den Block an der Schnittfläche zu befestigen und 50 oder 90 Mikrometer dicke Abschnitte am Vibratom mit einer Geschwindigkeit von 0,075 Millimetern pro Sekunde bei einer 100-Hertz-Frequenz zu erhalten.
Dann verwenden Sie einen autoklavierten natürlichen Haarpinsel, um die Abschnitte in einzelne Brunnen einer 24 Brunnen-Gewebekulturschale zu übertragen, die einen Milliliter eiskalte Se-PBS pro Brunnen enthält, wie sie erhalten werden. Wenn alle Abschnitte erworben wurden, verwenden und autoklavierten Mikrospachtel, um die Abschnitte in einzelne 0,4 Mikrometer Gießgröße Membraneinsätze in jedem Brunnen einer 24 Brunnengewebe kulturplatte mit 300 Mikroliter Vibratome Kulturmedium pro Brunnen zu übertragen. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit Feuchtigkeit, erfrischen Sie das Medium in der Unterseite jedes Brunnens, und fügen Sie 40 Mikroliter Medium auf die Membran Einsätze jeden zweiten Tag, wie für bis zu 30 Tage benötigt.
Um das Gewebe zu bestrahlen, übertragen Sie die Abschnitte in einem abgedeckten Styroporbehälter zur Bestrahlung der Strahlenanlage, um Temperaturschwankungen zu vermeiden und die Abschnitte mit einer einzigen fünfstufigen Strahlendosis zu behandeln. Dann kehren Sie die Kulturen zu einem strahlungssicheren Gewebekultur-Inkubator zurück. Für die Antikörperfärbung der Gewebeabschnitte die Proben mit mindestens zwei fünfminütigen Waschungen in sterilem PBS waschen und die Abschnitte in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius über Nacht fixieren.
Am nächsten Morgen waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS ergänzt mit 1%rinder Serumalbumin und 0.1%Triton X-100, oder PBT, bevor die Gewebe mit 0.3%Triton X-100 in PBS für 30 Minuten permeabilisieren. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBT, wie gezeigt, bevor Sie jede unspezifische Bindung mit Blockiermittel blockieren, die mit 1% normalem Ziegenserum für eine Stunde ergänzt werden. Dann inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in den entsprechenden primären Antikörper von Interesse.
Helle Feldmikroskopbilder von primären 2D Speicheldrüsenabschnittskulturen zeigen das Vorhandensein von lebensfähigen Geweben für bis zu 30 Tage Kultur unter allen Konzentrationen der getesteten Serumergänzung. Die proliferative Kapazität dieser repräsentativ kultivierten Scheiben wurde durch Ki-67-Immunostainierung bewertet und dieser Marker wurde zu allen Zeitpunkten beobachtet. Ein niedriger Gehalt an Cleaved Caspase-3-positiven Zellen wurde auch zu allen Zeitpunkten beobachtet, wobei ein kleiner Anstieg an Tag 30 festgestellt wurde.
E-Cadherin Färbung wurde sowohl in der submandibulären und Ohrspeicheldrüsenscheiben während der 30-Tage-Kulturperiode beobachtet. Glatte Muskel-Actin-positive Zellen und zytoskelettale Organisation wurden auf ähnlichen Ebenen während der gesamten Kulturperiode nachgewiesen. In ähnlicher Weise wurden auch funktionelle Proteine wie Amylase und Aquaporin-5 nachgewiesen, obwohl am 14. Tag die Färbung granularer zu sein schien.
Im Gegensatz dazu wurden CD31 und TUBB3 während der gesamten Kulturperiode in beiden Drüsen nicht einheitlich ausgedrückt, was darauf hindeutet, dass es eine Vielfalt von Gewebebestandteilen gibt, die während des 30-tägigen Kulturzeitraums für unterschiedliche Zeiträume gepflegt werden. Bestrahlte Scheiben in beiden Drüsen imitierten ähnliche proliferative apoptotische und zytoskelettale Veränderungen, die in vivo beobachtet wurden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Abschnitte vom PBS-Bad im Vibratome auf die Kulturplatte und während der Färbungsverfahren bewegen, da die Abschnitte klein und empfindlich sind.
Die Schnittkulturen können mit den meisten Zelllinienkulturmethoden behandelt werden, mit dem zusätzlichen Vorteil, unter Bedingungen zu sein, die enger mit in vivo verwandt sind. Wir gehen davon aus, dass dies eine leistungsstarke Technik für andere Forscher sein wird, um sie in ihre Experimente zu integrieren. Die Klinge auf dem Vibratom ist scharf und kann schwierig sein, so müde bei der Handhabung zu setzen.
Auch Trypan-Blaufarbstoff ist giftig und krebserregend, also folgen Sie allen PP-Richtlinien.
