يسمح هذا البروتوكول بتقييم التفاعلات بين الخلايا إلى الخلايا بين أنواع الخلايا المتنوعة داخل الأنسجة ، والتلاعبات الجزيئية والصيدلانية السابقة vivo التي ستكون أقل جدوى في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الفترة الممتدة من الوقت يمكن الحفاظ على هذه المقاطع الأنسجة في الثقافة مما يسمح بتقييمها في وقت لاحق. هذه التقنية سوف تسمح للفحص أكثر سرعة من المركبات العلاجية لتصحيح تلف الغدة اللعابية، وسوف يقلل من المرجح عدد الفئران المستخدمة لهذه الدراسات.
ونحن نخطط لاستخدام هذه التقنية لفهم استجابة الغدة اللعابية للعلاج الإشعاعي في نقاط زمنية وسيطة وتشغيل الجينات وإيقاف تشغيلها على فترات محددة. الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تقسيم الأنسجة ومنع فقدان أقسام الأنسجة أثناء الثقافة وخطوات التلوين. قبل البدء في عملية تطهير مكونات هزاز للانفصال مع 70٪ الإيثانول، تليها الأشعة فوق البنفسجية التعقيم لمدة 30 دقيقة على الأقل.
تأمين ورقة إضافية من فيلم المختبر على علبة العازلة لمنع الجليد من السقوط في، وملء غرفة الجليد مع الجليد سحقت. إزالة الفيلم المختبر من علبة العازلة وملء علبة العازلة مع 100 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني تكملها 1٪ البنسلين بكتيريا الدمبيلين، أو PSA. ثم ضع شفرة حلاقة من الفولاذ المقاوم للصدأ في حامل الشفرة واستخدم مفكًا لتسهيل ضبط زاوية النصل.
بعد عزل الغدد اللعابية، ضع الأنسجة المحصودة في طبق ثقافة معقمة 30 ملليمتر يحتوي على ملليلترين من PBS الباردة الجليد تكملها 1٪ PSA. باستخدام ملقط autoclaved، نقل الغدد إلى الجزء السفلي من التضمين العفن وتغطية الأنسجة مع السائل 3٪ نقطة انصهار منخفضة agarose. باستخدام ملقط، وضبط الأنسجة إلى منتصف الكتلة في الطائرة المناسبة، ووضع كتلة agarose على الجليد لمدة 10 دقائق.
عندما تصلب agarose، تشغيل بعناية شفرة حلاقة حول الحافة الخارجية للقالب والسماح للقطع كتلة الخروج على الفيلم مختبر الأشعة فوق البنفسجية المعقمة. استخدام شفرة الحلاقة لقطع مربع agarose التي تحتوي على الغدة اللعابية، مع الحرص على أن الطائرة من القسم مستقيمة ومتوازية مع الجانب الآخر من الكتلة. استخدم superglue لإرفاق الكتلة على سطح القطع والحصول على 50 أو 90 ميكرومتر سميكة على هزاز بسرعة 0.075 ملليمتر في الثانية بمعدل تردد 100 هرتز.
ثم استخدام فرشاة طلاء الشعر الطبيعية autoclaved لنقل المقاطع إلى آبار فردية من 24 طبق ثقافة الأنسجة جيدا تحتوي على ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS في جيدا كما يتم الحصول عليها. عندما تم الحصول على جميع المقاطع، واستخدام وملعقة صغيرة autoclaved لنقل المقاطع إلى الفردية 0.4 ميكرومتر صب حجم غشاء إدراج في كل بئر من 24 بئر لوحة ثقافة الأنسجة التي تحتوي على 300 ميكرولترات من ثقافة هزاز المتوسطة في البئر. ثم ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة ، منعشة المتوسطة في الجزء السفلي من كل بئر ، وإضافة 40 ميكرولترات من المتوسط إلى الغشاء يدخل كل يومين حسب الحاجة لمدة تصل إلى 30 يومًا.
لشعاع الأنسجة، نقل الأقسام إلى مرفق المشعع في حاوية الستايروفوم المغطاة لتجنب تقلبات في درجة الحرارة وعلاج الأجزاء بجرعة واحدة من الإشعاع من خمس درجات. ثم العودة الثقافات إلى حاضنة ثقافة الأنسجة الآمنة الإشعاع. لصبغ الأجسام المضادة من أقسام الأنسجة، وغسل العينات مع اثنين على الأقل خمس دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني عقيمة وإصلاح المقاطع في 4٪ paraformaldehyde في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي غسل الأقسام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني تكملها 1٪ البوم مصل البقر و0.1٪ تريتون X-100، أو PBT، قبل permeabilizing الأنسجة مع 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. غسل المقاطع ثلاث مرات في PBT كما هو موضح قبل حظر أي ربط غير محدد مع عامل حظر تكملها مصل الماعز العادي 1٪ لمدة ساعة واحدة. ثم احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة.
صور المجهر الميداني مشرق من الثقافات الأولية قسم الغدد اللعابية 2D تكشف عن وجود الأنسجة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 30 يوما من الثقافة تحت جميع تركيزات مكملات المصل اختبارها. تم تقييم القدرة التكاثرية لهذه الشرائح المُزرعة التمثيلية بواسطة الكبت المناعي من نوع Ki-67، وقد لوحظ هذا المؤشر في جميع النقاط الزمنية التي تم تقييمها. لوحظ أيضا انخفاض مستوى الخلايا الإيجابية Cleaved Caspase-3 في جميع النقاط الزمنية مع زيادة صغيرة اكتشفت في اليوم 30.
لوحظ تلطيخ E-cadherin في كل من شرائح الغدة السفلية والرقية خلال فترة الثقافة 30 يومًا. تم الكشف عن العضلات الملساء actin إيجابية الخلايا والتنظيم الهيكلية للخلايا في مستويات مماثلة طوال فترة الثقافة. وبالمثل، تم الكشف عن البروتينات الوظيفية مثل الأميليز وأكوابورين-5 أيضا، وإن كان في اليوم 14 يبدو أن تلطيخ أكثر الحبيبية.
وعلى النقيض من ذلك، لم يتم التعبير عن CD31 و TUBB3 باستمرار طوال فترة الثقافة في كلا الغدد، مما يشير إلى وجود تنوع في مكونات الأنسجة التي تم الحفاظ عليها لفترات زمنية مختلفة طوال فترة الثقافة 30 يومًا. شرائح المشعة في كل من الغدد تحاكي مماثلة تكاثري اpoptotic والتغيرات في الجسم الحركي لوحظ في الجسم الحي. كن حذرا عند نقل المقاطع من حمام برنامج تلفزيوني في هزاز لوحة الثقافة وأثناء إجراءات تلطيخ كما هي أقسام صغيرة وحساسة.
يمكن التعامل مع الثقافات القسم مع معظم أساليب ثقافة خط الخلية مع فائدة إضافية من يجري تحت الظروف التي ترتبط بشكل وثيق أكثر في vivo. ونتوقع أن تكون هذه تقنية قوية لباحثين آخرين لدمجهم في تجاربهم. النصل على هزاز حاد ويمكن أن يكون من الصعب إدراج ذلك يكون متعبا عند التعامل معها.
أيضا trypan صبغة زرقاء سامة ومسرطنة حتى اتبع جميع المبادئ التوجيهية PP.
