이 프로토콜은 조직 내의 다양한 세포 유형 과 생체 내에서 덜 실현 될 것이다 ex vivo 분자 및 약리학적 조작 사이의 세포 상호 작용을 세포의 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 조직 섹션이 후기 시점에서 평가를 허용하는 배양에서 유지 될 수있는 시간의 연장 된 기간이다. 이 기술은 타액 선 손상을 정정하기 위하여 치료 화합물의 더 빠른 검열을 허용할 것이고 가능성이 이 연구 결과에 사용된 마우스의 수를 감소시킬 것입니다.
우리는 중간 시점에서 방사선 요법에 타액 선 반응을 이해하고 특정 간격으로 유전자를 켜고 끄는 이 기술을 사용할 계획입니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 조직 단면과 문화 및 염색 단계 동안 조직 섹션의 손실을 방지. 시술을 시작하기 전에 분리 가능한 진동 성분을 70% 에탄올로 소독한 다음 30분 이상 UV 살균을 합니다.
얼음이 떨어지는 것을 방지하기 위해 완충 트레이 위에 실험실 필름을 추가로 고정하고 얼음 챔버를 분쇄 된 얼음으로 채웁니다. 완충 용지에서 실험실 필름을 제거하고 1%페니실린 연쇄상 구균 암피실린 또는 PSA로 보충된 100밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 버퍼 트레이를 채웁니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 면도날을 블레이드 홀더에 넣고 스크루드라이버를 사용하여 블레이드 각도를 조절합니다.
타액 땀샘을 격리한 후 수확한 조직을 1%PSA로 보충한 2밀리리터의 얼음차가운 PBS를 함유한 멸균 30mm 배양 접시에 넣습니다. 자동 식 포셉을 사용하여 땀샘을 배임 금형의 바닥으로 옮기고 액체 3 % 낮은 융점 아가로즈로 조직을 덮습니다. 집게를 사용하여, 적절한 평면에서 블록의 중간에 조직을 조정하고, 10 분 동안 얼음에 아가로즈 블록을 배치합니다.
아가로즈가 경화되면 금형의 바깥쪽 가장자리 주위에 면도날을 조심스럽게 실행하고 블록이 UV 멸균 실험실 필름위로 밀어 내도록 합니다. 면도날을 사용하여 타액선이 들어 있는 아가로즈 박스를 잘라내어 단면의 평면이 블록의 반대쪽과 직선적이고 평행하다는 것을 주의하십시오. 초접착제를 사용하여 절단 표면에 블록을 부착하고 진동에 50 또는 90 마이크로 미터 두께의 섹션을 초당 0.075 밀리미터의 100 헤르츠 주파수에서 가져옵니다.
그런 다음 오토클레이브 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 24 개의 잘 조직 배양 접시에 옮기고 1 밀리리터의 얼음 차가운 PBS를 함유하고 얻어집니다. 모든 단면을 획득하면, 각 항면을 개별 0.4 마이크로미터로 옮기기 위해 마이크로 주걱을 사용하여 300 마이크로리터의 진동배양 배지를 함유한 24개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 웰에 크기 막 인서트를 부어 넣는다. 그런 다음 37도 의 섭씨 37도 및 습도가 있는 이산화탄소 인큐베이터 5%에 플레이트를 배치하고, 각 우물의 바닥에 있는 배지를 새로 고치고, 최대 30일 동안 필요에 따라 매일 40마이크로리터의 배지를 멤브레인서에 첨가한다.
조직을 조사하려면, 온도의 변동을 방지하기 위해 덮여 스티로폼 용기에 있는 조사시설에 섹션을 전송하고 방사선의 단 5 급 복용량으로 단 5 등급의 복용량으로 단 5 등급의 섹션으로 단 처리합니다. 그런 다음 배양을 방사선 안전한 조직 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 조직 섹션의 항체 염색을 위해, 멸균 PBS에서 적어도 2 5 분 세척으로 견본을 세척하고 밤새 섭씨 4도에서 4%paraformaldehyde에 있는 단면도를 수정합니다.
다음날 아침 PBS는 PBS에서 1%소 세럼 알부민과 0.1%트리톤 X-100 또는 PBT로 보충한 PBS로 3회 세척한 후 PBS에서 0.3%트리톤 X-100으로 조직을 30분 동안 세척한다. 1시간 동안 1%일반 염소 세럼으로 보충된 블로킹제로 비특이적 결합을 차단하기 전에 PBT에서 섹션을 세 번 세척하십시오. 그런 다음 적절한 1 차 항체에서 하룻밤 동안 섹션을 배양합니다.
1 차적인 2D 침샘 단면도 배양의 밝은 필드 현미경 심상은 시험된 혈청 보충의 모든 집중에서 문화의 최대 30 일 동안 실행 가능한 조직의 존재를 보여줍니다. 이러한 대표적인 배양 슬라이스의 증식 능력은 Ki-67 면역염색에 의해 평가되었고, 이 마커는 항상 평가된 시점에서 관찰되었다. 칼 카스파세-3 양성 세포의 낮은 수준은 또한 30일째에 검출된 작은 증가와 가진 모든 시점에서 관찰되었습니다.
E-cadherin 염색은 30일 간의 배양 기간 동안 서브만디브 및 파로티드 선 슬라이스 모두에서 관찰되었다. 원활한 근육 액틴 양성 세포 및 세포 골격 조직은 배양 기간 동안 유사한 수준에서 검출되었다. 유사하게, 아밀라제 및 아쿠아포린-5와 같은 기능성 단백질도 검출되었고, 14일째에도 염색이 더 세분화된 것으로 나타났다.
대조적으로, CD31 및 TUBB3는 양동맥에 있는 배양 기간 내내 일관되게 표현되지 않았으며, 30일 배양 기간 동안 상이한 기간 동안 유지되는 조직 성분의 다양성이 있다는 것을 시사합니다. 두 땀샘에 있는 조사된 조각은 생체에서 관찰된 유사한 증식 세포질 및 세포골격변화를 모방했습니다. 비브라토메의 PBS 욕조에서 배양판으로 섹션을 이동할 때, 그리고 단면이 작고 섬세하기 때문에 염색 절차 중에 주의하십시오.
단면 배양은 생체 내와 더 밀접하게 관련된 조건하에서 추가된 이점을 가진 대부분의 세포주 배양 방법으로 취급될 수 있다. 우리는 이것이 다른 연구자들이 그들의 실험에 통합하는 강력한 기술이 될 것으로 예상합니다. 진동의 블레이드는 날카롭고 처리 시 지친 삽입이 어려울 수 있습니다.
또한 트라이판 블루 염료는 독성과 발암성이므로 모든 PP 지침을 따르십시오.
