光遗传学等光学方法可以提供细胞分子信号的精确调制。我们的协议演示了通过飞秒激光刺激对细胞信号分子进行口头光学操作。通过将我们的飞秒激光耦合到共和显微镜中，我们的技术可以通过飞秒激光刺激和通过共和显微镜进行实时分子动态监测来提供单细胞或亚细胞水平操作。
该方法可应用于任何荧光显微镜系统，以适当的方式将飞秒激光耦合到系统中。对于任何首次尝试我们的方法的人，请按照激光设施的单独说明操作，或在操作实验室飞秒激光源时寻求专业人士的指导。首先，打开飞秒激光器和共合显微镜。
使用反射镜通过机械快门引导飞秒激光束。接下来，设置一个由一对透镜组成的中继望远镜，以扩大传输光束宽度。这应该与目标的后孔径一致。
现在，引导反射镜将展开的光束与显微镜对齐。调整两个反射镜，这里指出，将飞秒激光的焦点调整到视场的中心。最后，测量和调整激光，如随附的文本协议中所述。
使用标准技术培养希拉细胞。当准备执行实验时，使用随附的文本协议中描述的 ERK2-GFP 转染细胞。接下来，打开激光扫描共声显微镜和飞秒激光。
确保激光快门已关闭。然后，打开显微镜软件。将激励激光器设置为 488 纳米，将其功率级别设置为 0.1 毫瓦。
将成像大小设置为 512 x 512 像素，将每个像素的间隔时间设置为 2.4 微秒。然后，将两帧之间的间隔时间设置为六秒，以尽量减少照片漂白和照片对细胞的伤害。此外，将总成像帧设置为大约 300 帧，在单个实验中提供约 30 分钟的连续显微镜。
从培养箱中取出含有与ERK2-GFP一起转染的希拉细胞的盘子，将该培养皿放在显微镜舞台上。在软件中，启动快速扫描模式，并调整目标，以获得清晰的荧光图像的细胞。然后，停止快速扫描并使用 CCD 摄像机切换到亮场成像模式。
打开快门并调整继电器望远镜的两个镜头之间的距离，以确保飞秒激光对焦的直径约为 2 微米。然后，关闭快门以完成调整。将 810 纳米激光的飞秒激光功率设置为 15 至 40 毫瓦，1040 纳米激光的功率设置为 20 至 60 毫瓦。
然后，将快门打开时间设置为 05 至 0.2 秒。使用快速扫描模式选择强烈表达 ERK2-GFP 的目标单元。找到后，移动舞台以定位选定目标细胞的细胞索区域，以便在亮场成像下处于视场的中心。
居中后，单击"开始"按钮开始连续成像。在任何预定义时隙打开快门，将飞秒激光刺激传递到目标单元。成像过程完成后，保存成像数据以进行进一步分析。
将飞秒激光的功率设置为 15 至 40 毫瓦和 810 纳米，在试样时设置为 20 至 60 毫瓦和 1040 纳米。然后，从培养箱中取出含有与ERK2-GFP转染的细胞的培养皿，并放在显微镜的舞台上。使用快速扫描模式选择表达 ERK2-GFP 的目标单元。
然后，设置共声成像过程，并定义一个特殊的扫描帧作为成像过程的刺激帧。定义刺激帧的参数。在靠近目标细胞核的细胞索尔区域设置2到3平方微米的扫描区域。
将总扫描时间设置为 0.1 到 0.2 秒。将两帧之间的间隔时间设置为 6 秒，将总成像帧设置为大约 300 帧，以提供大约 30 分钟的连续显微镜。保存成像数据以进行进一步数据分析。
根据预定义的照片刺激区域，将飞秒激光的快门与共声扫描的快门同步，只有在激光扫描在刺激帧中下降时，该光秒激光的快门才打开。单击"开始"按钮开始连续显微镜成像过程。为了观察线粒体形态动力学，用米托-GFP转染希拉细胞以荧光指示线粒体，或用线托-cpYFP来观察线粒体的基座。
转染后，打开飞秒激光，确保快门关闭。然后，打开激光扫描共声显微镜。将激励激光设置为 488 纳米。
然后，将 488 纳米激光器的功率级别设置为 0.1 毫瓦。此外，将成像大小设置为 512 x 512 像素，将每帧的总成像时间设置为 2.2 秒。然后，将两帧之间的间隔时间设置为零秒，将总成像帧设置为 200 帧，以在单个实验中提供约 440 秒的连续显微镜。
从培养箱中取出含有与线托 GFP 或线粒体靶向的圆形黄色荧光蛋白的培养皿，将培养皿放在显微镜舞台上。检查飞秒激光器的状态，确保飞秒激光器的焦点位于视场的中心。然后，在荧光成像窗口的中心设置一个参考箭头，以指示焦点的位置。
接下来，将飞秒激光的功率设置为 5 到 30 毫瓦，激光功率为 810 纳米，激光功率为 10 至 40 毫瓦，功率为 1040 毫米。将快门的打开时间设置为 05 至 0.1 秒。使用快速扫描模式选择表达良好的线托 GFP 目标细胞或线粒体靶向圆形黄色荧光蛋白。
在靶细胞中随机选择一个线粒体作为实验对象。接下来，移动显微镜阶段，以便通过参考箭头所示的快速扫描模式，在视场中心定位目标线粒体管状结构。单击"开始"按钮开始连续成像。
最后，在任何预定义时间打开快门，将飞秒激光刺激传递到目标线粒体管状结构中。等待成像过程完成，然后保存成像数据以进行进一步的数据分析。使用本协议中介绍的方法，ERK2在经过短速的飞秒激光处理后，会进入核。
ERK2-GFP荧光在经过几分钟的飞秒激光刺激后达到最大值。ERK2 分子在激活核中的下游基质后将被脱磷化，然后 ERK2 回到核 GFP 荧光减少所指示的细胞质。ERK2 可以通过多次照片刺激多次激活。
因此，可以通过控制多个刺激之间的间隔时间来精确操作 ERK2 信号模式。此外，ERK2偶尔可以在刺激细胞周围的相邻细胞中激活。此观察表明，使用飞秒激光处理的细胞可能释放一些可扩散分子，以激活相邻细胞中的 ERK2。
ERK2下游蛋白eIF4E的磷酸化可以通过免疫荧光显微镜进行确认。结果表明，飞秒激光刺激能成功激活ERK信号通路。线粒体氧化闪光或三叶草是线粒体的氧化爆发，根系于复杂的分子动力学。
实施此照片刺激方案，成功进行了三闪性激发。此照片刺激还显示各种线粒体分子动力学，包括线粒体形态的碎片和恢复，以及线粒体膜电位振荡。与照片激活的三毛线相似，这些线粒体事件具有不同的功率强度的不同性能。
最重要的是确保飞秒激光器的焦点、大小和精度是细胞刺激的一个属性。近红外飞秒激光器可能危害用户。遵循此协议时，请佩戴适当的保护，防止激光从光学表扩散出来。
