Los métodos ópticos, como la optogenética, pueden proporcionar la modulación precisa de las señales moleculares celulares. Nuestro protocolo demostró una manipulación óptica oral de las moleculares de la señal celular por estimulación láser de femtosegundo. Al acoplar nuestro láser de femtosegundo en un microscopio confocal, nuestra técnica puede proporcionar una operación de nivel unicelular o subcelular mediante estimulación láser de femtosegundo y la monitorización dinámica molecular en tiempo real mediante microscopía confocal.
Este método se puede aplicar a cualquier sistema de microscopía fluorescente mediante el acoplamiento de un láser de femtosegundo en el sistema de la manera adecuada. Para cualquier persona que esté probando nuestro método por primera vez, por favor siga las instrucciones separadas de la instalación láser o busque la guía de los profesionales al operar una fuente láser de femtosegundo de laboratorio. Para empezar, encienda el láser de femtosegundo y el microscopio confocal.
Utilice espejos reflectantes para dirigir el rayo láser de femtosegundo a través de un obturador mecánico. A continuación, establezca un telescopio de relé que consta de un par de lentes para ampliar el ancho del haz de transmisión. Esto debe ser consistente con la apertura posterior del objetivo.
Ahora, dirija los espejos reflectantes para alinear el haz expandido en el microscopio. Ajuste los dos espejos reflectantes, señalados aquí, para ajustar el enfoque del láser de femtosegundo al centro del campo de visión. Por último, mida y ajuste los láseres como se describe en el protocolo de texto adjunto.
Células hela de cultivo utilizando técnicas estándar. Cuando esté listo para realizar el experimento, transfeque las celdas con ERK2-GFP como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, encienda el microscopio confocal de escaneo láser y el láser de femtosegundos.
Asegúrese de que el obturador del láser esté cerrado. A continuación, abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 488 nanómetros y establezca su nivel de potencia en 0,1 milivatios.
Establezca el tamaño de imagen como 512 por 512 píxeles y el tiempo de intervalo de cada píxel como 2,4 microsegundos. A continuación, establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas a seis segundos para minimizar el blanqueo fotográfico y el daño fotográfico a las células. Además, establezca los marcos de imágenes totales en alrededor de 300 fotogramas para proporcionar unos 30 minutos de microscopía continua en un experimento individual.
Tome el plato que contiene las células hela transfectados con ERK2-GFP de la incubadora, y poner el plato en la etapa del microscopio. En el software, inicie el modo de escaneo rápido y ajuste el objetivo de adquirir imágenes fluorescentes claras de las células. A continuación, detenga el escaneo rápido y cambie al modo de imagen de campo brillante con la cámara CCD.
Abra el obturador y ajuste la distancia entre las dos lentes del telescopio de relé para asegurarse de que el diámetro del enfoque láser de femtosegundo es de aproximadamente dos micras. A continuación, cierre el obturador para completar el ajuste. Establezca la potencia del láser de femtosegundo en 15 a 40 milivatios para un láser de 810 nanómetros, o un láser de 20 a 60 milivatios para un láser de 1040 nanómetros.
A continuación, ajuste el tiempo de apertura del obturador en 05 a 0,2 segundos. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar una celda de destino que exprese fuertemente ERK2-GFP. Una vez encontrado, mueva el escenario para localizar el área del citosol de la celda de destino seleccionada de modo que esté en el centro del campo de visión cuando esté bajo imágenes de campo brillante.
Una vez centrado, haga clic en el botón de inicio para comenzar la toma de imágenes continuas. Abra el obturador en cualquier intervalo de tiempo predefinido para entregar la estimulación láser de femtosegundos en la célula de destino. Una vez completado el proceso de creación de imágenes, guarde los datos de imágenes para su análisis posterior.
Establezca la potencia del láser de femtosegundo en 15 a 40 milivatios y 810 nanómetros y de 20 a 60 milivatios y 1040 nanómetros en la muestra. Luego, tome el plato que contiene las células transfectantes con ERK2-GFP de la incubadora y colóquelo en la etapa del microscopio. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar bien la celda de destino que expresa ERK2-GFP.
A continuación, configure el proceso de imágenes confocales y defina un marco de escaneo especial como el marco de estimulación en el proceso de creación de imágenes. Defina el parámetro del marco de estimulación. Establezca una región de exploración de dos por dos a tres por tres micras cuadradas en el área del citosol cerca del núcleo en la célula objetivo.
Establezca el tiempo total de escaneo en 0,1 a 0,2 segundos. Establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas en seis segundos y establezca los fotogramas de imagen totales en alrededor de 300 fotogramas para proporcionar unos 30 minutos de microscopía continua. Guarde los datos de imágenes para realizar análisis de datos adicionales.
Sincronice el obturador del láser de femtosegundo con el del escaneo confocal de acuerdo con el área de estimulación fotográfica predefinida que sólo está abierta cuando el escaneo láser cae en el marco de estimulación. Haga clic en el botón de inicio para iniciar el proceso de imágenes de microscopía continua. Para observar la dinámica morfológica mitocondrial, transfecta las células de Hela con Mito-GFP para indicar fluorescentemente las mitocondrias, o una base con mito-cpYFP para observar mitoflashos.
Después de la transfección, encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado. A continuación, encienda el microscopio confocal de escaneo láser. Ajuste el láser de excitación a 488 nanómetros.
A continuación, establezca el nivel de potencia del láser de 488 nanómetros en 0,1 milivatios. Además, establezca el tamaño de imagen en 512 por 512 píxeles y el tiempo total de imagen de cada fotograma en 2,2 segundos. A continuación, establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas en cero segundos y el total de fotogramas de imagen como 200 fotogramas para proporcionar unos 440 segundos de microscopía continua en un experimento individual.
Tome el plato que contiene las células transfectadas con mito GFP o proteína fluorescente amarilla permutada circularmente dirigida a mitocondrialmente de la incubadora y coloque el plato en la etapa del microscopio. Compruebe el estado del láser de femtosegundo para asegurarse de que el foco del láser de femtosegundo se encuentra en el centro del campo de visión. A continuación, establezca una flecha de referencia en el centro de la ventana de imágenes fluorescentes para indicar la posición del foco.
A continuación, establezca la potencia del láser de femtosegundo en de cinco a 30 miliwatts con el láser en 810 nanómetros y de 10 a 40 milivatios para el láser a 1040 nanómetros. Ajuste el tiempo de apertura del obturador a 05 a 0,1 segundos. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar la célula de destino que está expresando bien mito GFP o la proteína fluorescente amarilla móvil circular de objetivo mitocondrial.
Seleccione un mitocondrio aleatoriamente en la célula objetivo como sujeto experimental. A continuación, mueva la etapa del microscopio para localizar la estructura tubular mitocondrial objetivo en el centro del campo de visión mediante el modo de escaneo rápido como se indica en la flecha de referencia. Haga clic en el botón de inicio para iniciar la creación de imágenes continuas.
Finalmente, abra el obturador en cualquier momento predefinido para entregar la estimulación láser de femtosegundos en la estructura tubular mitocondrial objetivo. Espere hasta que se complete el proceso de creación de imágenes y, a continuación, guarde los datos de imágenes para un análisis de datos adicional. Utilizando el método presentado en este protocolo, ERK2 se transloca en el núcleo después de ser tratado con un breve destello del láser de femtosegundo.
La fluorescencia ERK2-GFP alcanza el máximo después de varios minutos de estimulación láser de femtosegundo. Las moléculas ERK2 serán desfosforiladas después de activar sustratos aguas abajo en el núcleo y luego el ERK2 vuelve al citoplasma indicado por una disminución de la fluorescencia nuclear de la GFP. ERK2 se puede activar varias veces mediante múltiples estimulaciones fotográficas.
Por lo tanto, es posible manipular el patrón de señal ERK2 con precisión controlando el tiempo de intervalo entre múltiples estímulos. Además, el ERK2 ocasionalmente se puede activar en células adyacentes alrededor de la célula estimulada. Esta observación indica que algunas moléculas difusibles pueden ser liberadas por la célula tratada con el láser de femtosegundo para activar ERK2 en las células adyacentes.
La fosforilación de la proteína eIF4E descendente ERK2 se puede confirmar individualizada mediante microscopía de inmunofluorescencia. Este resultado indica que la estimulación láser de femtosegundo puede activar con éxito la vía de señalización ERK. Los destellos oxidativos mitocondriales o mitoflashos son ráfagas oxidativas en las mitocondrias que arraigan a partir de dinámicas moleculares complejas.
La implementación de este esquema de estimulación fotográfica dio lugar a una excitación mitoflash exitosa. Esta estimulación foto también muestra variedades de dinámica molecular mitocondrial incluyendo la fragmentación y restauración de la morfología mitocondrial, así como la oscilación del potencial de la membrana mitocondrial. Al igual que las mitoflashes fotoactivadas, estos eventos de mitocondrias tienen un rendimiento diferente con diferentes intensidades de potencia.
Lo más importante es asegurarse de que el enfoque, el tamaño y la precisión del láser de femtosegundo es una propiedad para la estimulación en las células. El láser de femtosegundo casi infrarrojo puede ser peligroso para los usuarios. Al seguir este protocolo, use la protección adecuada y evita que el láser se difunda de la mesa óptica.
